張慧君 陳又銘 沙迪昕 姜寧寧 王文霞 宮春宇

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

玉米醇溶蛋白(zein)是玉米淀粉工業(yè)中濕法加工的副產(chǎn)物——玉米黃粉中的重要蛋白質(zhì)，因其富含疏水性氨基酸，缺少必需氨基酸，早期常作為工業(yè)廢料排放，目前主要制成動(dòng)物飼料外銷(xiāo)［1］。然而，玉米醇溶蛋白雖然工業(yè)附加值較低，但具有良好的成膜特性［2］。國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究已經(jīng)持續(xù)多年，尤其在制備果蔬和肉制品保鮮涂膜方面進(jìn)行了一些研究和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)［3－5］。卻幾乎沒(méi)有得到工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際商業(yè)應(yīng)用。這主要是因?yàn)榧冇衩状既艿鞍椎哪べ|(zhì)較脆，易斷裂，機(jī)械力學(xué)穩(wěn)定性很差，不能滿足作為包裝材料的力學(xué)強(qiáng)度以及產(chǎn)品貨架期等要求［6］。

目前，提高植物蛋白膜機(jī)械性能的常用方法為塑化改性［7－9］，但是這種添加塑化劑的改性方法存在化學(xué)試劑殘留、形成有毒的氨基酸衍生物和改變營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等弊端［10］。蛋白質(zhì)的糖基化改性僅通過(guò)加熱就能促使糖基化反應(yīng)自發(fā)地進(jìn)行［11］，接枝產(chǎn)物具有一定的安全性和可操作性，通常包括固相體系的干熱糖基化和液相體系濕熱糖基化［12］。其中濕熱糖基化具有反應(yīng)時(shí)間短，速度快等優(yōu)點(diǎn)，它是將蛋白質(zhì)和單糖或低聚糖的緩沖溶液直接加熱進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束迅速冷卻，再冷凍干燥得到共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物，這種形成新結(jié)構(gòu)的交聯(lián)產(chǎn)物可較好地改善其功能特性。孔繁惠等［13］采用葡萄糖對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行濕法糖基化改性，結(jié)果顯示改性后的玉米醇溶蛋白溶解度比原來(lái)提高了1.84倍。劉娟等［14］研究用葡聚糖對(duì)酪蛋白進(jìn)行糖基化改性，改性產(chǎn)物的乳化性比原來(lái)提高了1.5倍。PHAM等［15］利用在真空中糖基化的新技術(shù)將葡萄糖共價(jià)連接到胰蛋白酶和糜蛋白酶的Lys殘基上，與未糖基化者相比，糖基化的這兩種酶的熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。

麥芽糖漿(Maltose Syrup，MS)作為一種食品常用的甜味劑，價(jià)廉易得。本研究麥芽糖漿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行濕熱法糖基化改性，提高其機(jī)械強(qiáng)度，利用得到的交聯(lián)產(chǎn)物zein－MS制備膠囊殼，擴(kuò)大玉米醇溶蛋白在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白(70%乙醇提取，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%):自制;麥芽糖漿，中糧公主嶺生化能源有限公司;辣根過(guò)氧化物酶、低分量蛋白標(biāo)樣:上海生物生工有限公司;十二烷基硫酸鈉:天津市耀華化學(xué)試劑公司;β－巰基乙醇:天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QTS－25質(zhì)構(gòu)儀;Q－20DSC差示掃描量熱儀;FI－IR/NIR傅里葉變紅外光譜分析儀;s－3400掃描電子顯微鏡;WSL－1000D超聲波信號(hào)發(fā)生器;LYOQUEST－85真空冷凍干燥機(jī);GBCY01數(shù)顯膜測(cè)厚儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖基化反應(yīng)產(chǎn)物

用70%乙醇溶液溶解，配制成8% 玉米醇溶蛋白乙醇溶液，按照玉米醇溶蛋白∶MS質(zhì)量比為9∶1的比例加入麥芽糖漿，混勻，調(diào)節(jié)體系pH，取變幅桿φ6、功率400 W超聲10 min，70℃磁力攪拌15 min，冷卻(4℃)，終止糖基化反應(yīng)。

1.3.2 膜和膠囊殼的制備

稱取糖基化改性產(chǎn)物zein－MS用70%乙醇溶解配成8%的樣品溶液，在70℃下磁力攪拌30 min進(jìn)行溶膠。如制備膜則將溶膠倒入不銹鋼模具置于70℃烘箱烘干成膜;如制備膠囊則將溶膠在預(yù)熱70℃的涂有植物油的1#膠囊殼模具上進(jìn)行蘸膠，烘干后，取出拔膠囊殼。最后將烘干后的膜或?qū)⒛覛ぴ?0℃，相對(duì)濕度為43%干燥器內(nèi)平衡48 h，進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 蛋白膜抗拉強(qiáng)度的測(cè)定

將膜剪成4 cm×1 cm的矩形長(zhǎng)條，置于質(zhì)構(gòu)儀拉伸探頭上，固定好，夾距設(shè)定為20 cm，拉伸速度為5 mm/s。計(jì)算如下式:

式中:TS為抗拉強(qiáng)度/MPa;F為最大拉力/N;L為膜樣品的厚度/mm(測(cè)厚儀在膜上均勻去10個(gè)點(diǎn)，準(zhǔn)確測(cè)定其厚度，取平均值);W為膜樣品的寬度/mm。

1.3.4 玉米醇溶蛋白改性后的SDS－PAGE凝膠電泳測(cè)定

1.3.4.1 樣品制備

分別配制3 g/L的玉米醇溶蛋白、zein－MS蛋白溶液，取20 μL溶液于1.00 mL離心管中與樣品緩沖溶液(0.5 mol/L Tris－ HCl，pH 6.8、甘油、10%SDS、0.1%溴酚蘭、β－巰基乙醇、雙蒸水)1∶1混合，10 000 r/min離心5 min，取上清液沸水浴中煮沸5 min后，冷卻備用。

將粉末狀的低分子質(zhì)量蛋白和辣根標(biāo)樣直接用200 μL 雙蒸水和200 μL 2 × 樣品緩沖液(0.5 mol/L pH 6.8 Tris－ HCl 2.0 mL、甘油 2.0 mL、10%SDS 4.0 mL、0.1%溴酚蘭 0.5 mL、β － 巰基乙醇 1.0 mL、雙蒸水 0.5 mL)溶解，分裝在離心管中，每管 20 μL，沸水浴中煮沸5 min后，冷卻備用。

1.3.4.2 電泳實(shí)驗(yàn)

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠。首先灌分離膠，水封，30 min后棄去水。灌濃縮膠，30 min后梳膠，置于電泳槽內(nèi)，注入電極緩沖液。每孔進(jìn)樣量為10 μL，連接電泳儀，恒壓控制，濃縮膠上所置電壓為80 V，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，電壓將提高到設(shè)定120 V，當(dāng)樣品帶遷移到距離膠板底部1 cm左右，關(guān)閉電源。

1.3.4.3 染色和脫色

玉米醇溶蛋白染色和脫色:蛋白質(zhì)樣品在電泳完畢，用固定液(含12.5%三氯乙酸，30%甲醇)固定1 h，然后將膠片放入染色液(含0.1%考馬斯亮藍(lán)R －250，10%甲醇，10%冰乙酸)染色2～4 h，然后用脫色液(冰乙酸∶甲醇∶水 =1∶1∶8)脫色 3 ～10 h，期間更換脫色液，至背景清楚。

zein－MS染色(PAS染色)和脫色:用糖蛋白固定液(12.5%三氯乙酸)固定膠片15 min，雙蒸水水洗2次，1%高碘酸氧化15 min，震蕩水洗5 min×3次，在希夫試劑避光染色，30 min，用脫色液(0.5%亞硫酸鈉)振蕩水洗5次，至條帶清晰。

1.3.5 蛋白膜紅外光譜掃描

采用FI－IR/NIR傅里葉變紅外光譜分析儀測(cè)試，掃描范圍在500 ～4 000 cm－1，分辨率 4 cm－1，掃描次數(shù)32次，對(duì)玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜進(jìn)行掃描。

1.3.6 熱力學(xué)性質(zhì)測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.004 0 mg的玉米醇溶蛋白和zein－MS樣品，分別放入2個(gè)鋁制坩堝中，用壓蓋機(jī)壓蓋密封。利用差式掃描熱儀以10℃/min的升溫速度從25℃加熱至250℃。以樣品坩堝相同的空?qǐng)遄鰧?duì)照參比，測(cè)定玉米醇溶蛋白和zein－MS的熱力學(xué)性質(zhì)。

1.3.7 蛋白膜微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定

將玉米醇溶蛋白膜和zein－MS共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物膜，剪成0.5 mm2的實(shí)驗(yàn)片，將樣品放入于掃描電鏡樣品座中，進(jìn)行真空鍍金處理，加速電壓為15 kV，對(duì)樣品表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類(lèi)膜抗拉強(qiáng)度比較

由于純玉米醇溶蛋白膜質(zhì)較脆，不能滿足膠囊殼的力學(xué)性能，本研究采用麥芽糖漿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行濕法糖基化改性，并將傳統(tǒng)的明膠膜、玉米醇溶蛋白膜與zein－MS膜進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖1所示。

對(duì)于硬膠囊殼，其抗拉強(qiáng)度值也并非越大越好，該值過(guò)大，失去硬膠囊的特點(diǎn)，變成軟膠囊。由圖1可知，傳統(tǒng)的明膠膠囊殼的抗拉強(qiáng)度(TS)為8.23 MPa，而純玉米醇溶蛋白膜的TS為4.67 MPa，實(shí)驗(yàn)中在脫模即后期保存時(shí)易碎，達(dá)不到制備膠囊殼的力學(xué)要求。采用麥芽糖漿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行濕熱法糖基化改性，制備的zein－MS膜的抗拉強(qiáng)度有所提高，TS增加為9.22 MPa，說(shuō)明糖基化改性過(guò)程中，玉米醇溶蛋白與MS發(fā)生了糖基化反應(yīng)，使分子的羥基數(shù)量增加，改變了玉米醇溶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，成膜后結(jié)合的水分也增多，從而減少分子間的作用力，增加了分子鏈的流動(dòng)性，使膜的柔韌性增強(qiáng)，膜抗拉強(qiáng)度得到提高［16－17］。

2.2 玉米醇溶蛋白改性后的SDS－PAGE凝膠電泳分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)是常規(guī)的蛋白質(zhì)定性檢驗(yàn)方法，染色多為考馬斯亮藍(lán)R－250，形成藍(lán)色條帶。而糖基化改性后得到的糖蛋白產(chǎn)物則使用高碘酸－Schiff(PAS)染色，得到粉紅色或淺紅色條帶。

圖2為玉米醇溶蛋白及其與麥芽糖漿進(jìn)行共價(jià)結(jié)合后的考馬斯亮藍(lán)染色圖和Schiff試劑糖蛋白染色圖。由圖2可知，考馬斯亮藍(lán)染色1泳道的玉米醇溶蛋白和2泳道改性的zein－MS條帶的分子質(zhì)量變化不明顯，這是因?yàn)辂溠刻菨{是經(jīng)α－1，4糖苷鍵連接兩個(gè)葡萄糖單位而成的雙糖，又稱為麥芽二糖，屬于小分子糖，因此，反應(yīng)后的接枝產(chǎn)物分子質(zhì)量變化不明顯，無(wú)法鑒定玉米醇溶蛋白是否與麥芽糖漿進(jìn)行糖基化反應(yīng)。以辣根過(guò)氧化物酶作為陽(yáng)性對(duì)照，采用PAS染色，1’泳道的玉米醇溶蛋白在1泳道相同位置呈現(xiàn)淡淡的淺紅色條帶，與文獻(xiàn)一致［18］，證明純的玉米醇溶蛋白分子本身含有少量的糖。2’泳道的zein－MS呈現(xiàn)了相對(duì)顏色略深的紅色條帶，說(shuō)明糖基化產(chǎn)物zein－MS分子中有糖基的存在，證明麥芽糖漿與玉米醇溶蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)，生成了蛋白質(zhì)和糖的交聯(lián)產(chǎn)物。

圖2 SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)和糖蛋白染色圖

2.3 蛋白膜FT－IR分析

傅里葉紅外光譜是常用于分析蛋白結(jié)構(gòu)的方法。蛋白質(zhì)的特征吸收峰包括酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動(dòng)(1 690～1 630 cm－1)、酰胺Ⅱ帶—NH彎曲振動(dòng)(1 530～1 560 cm－1)和酰胺Ⅲ帶C—N彎曲振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)(1 240～1 450 cm－1)。羥基的特征吸收峰有兩個(gè)，分別是—OH伸縮振動(dòng)吸收峰(3 700～3 200 cm－1)和 C—O 伸縮振動(dòng)吸收峰(1 100～1 000 cm－1)。

圖3為玉米醇溶蛋白與濕熱法糖基化產(chǎn)物zein－MS的傅里葉紅外光譜分析圖。相比未改性的玉米醇溶蛋白膜，酰胺Ⅰ帶的叔酰胺1 646 cm－1峰移至1 647 cm－1，振動(dòng)吸收峰變小發(fā)生藍(lán)移，該藍(lán)移來(lái)自于糖基化反應(yīng)后玉米醇溶蛋白的α－螺旋結(jié)構(gòu)減少［19］;酰胺Ⅱ帶的仲酰胺1 537 cm－1峰和酰胺Ⅲ帶1 243 cm－1峰均未移動(dòng)。這可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果:相比純的玉米醇溶蛋白，濕法糖基化改性后的zein－MS引入了新的麥芽糖鏈導(dǎo)致接枝后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中變化。另外，當(dāng)?shù)鞍着c糖分子共價(jià)交聯(lián)后，典型的特征就是羥基含量增加，在紅外光譜表現(xiàn)為羥基的特征吸收峰增強(qiáng)。圖3中改性的zein－MS膜在羥基伸縮振動(dòng)吸收峰 3 290 cm－1峰移至 3 288 cm－1峰，1 024 cm－1生成了新的 C—O伸縮振動(dòng)吸收峰，結(jié)果表明有新的羥基生成。綜上所述，傅里葉紅外譜圖證實(shí)原來(lái)玉米醇溶蛋白蛋白質(zhì)經(jīng)濕法糖基化后二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，與麥芽糖漿產(chǎn)生了共價(jià)交聯(lián)，生成的新結(jié)構(gòu)有助于提高蛋白膜的機(jī)械性能。

圖3 玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜的FT－IR光譜圖

2.4 熱性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)在高溫下加熱，肽鏈?zhǔn)艿捷^強(qiáng)的熱振蕩，蛋白質(zhì)的次級(jí)鍵如氫鍵等收到破壞，打亂了分子內(nèi)部有序排列，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，具有玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化行為。蛋白質(zhì)肽鏈在展開(kāi)過(guò)程中需要吸收能量，導(dǎo)致能量發(fā)生了變化［20］。濕法糖基化zein－MS的DSC掃描結(jié)果如圖4所示。

圖4 玉米醇溶蛋白和zein－MS的DSC圖

當(dāng)玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿發(fā)生了糖基化反應(yīng)時(shí)，如傅里葉紅外譜圖所示，玉米醇溶蛋白的空間結(jié)構(gòu)和鍵位次序都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，使熱變性時(shí)吸收的能量發(fā)生變化。由圖4可知，玉米醇溶蛋白膜的熱變性溫度約188.56℃，而采用麥芽糖漿對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行糖基化改性以后，改性后交聯(lián)產(chǎn)物的熱變性溫度上升至206.96℃，說(shuō)明通過(guò)濕熱法對(duì)玉米醇溶蛋白糖基化改性，交聯(lián)后的糖蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高了zein－MS的熱穩(wěn)定性。

2.5 蛋白膜SEM分析

合格的膜表面結(jié)構(gòu)要求盡可能少的裂紋，孔洞等現(xiàn)象，這些不良現(xiàn)象不僅會(huì)影響膜的外觀，尤其會(huì)導(dǎo)致膜機(jī)械性能變差。由圖5可知:1和1’為利用SEM對(duì)玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜放大1 000倍表面進(jìn)行觀察的結(jié)果，玉米醇溶蛋白膜表面存在或大或小的微小孔洞結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過(guò)濕熱法糖基化改性后的交聯(lián)產(chǎn)物zein－MS制備成膜后，觀察膜表面微孔結(jié)構(gòu)消失，形成一些淺的凹陷，表面相對(duì)比較平整。當(dāng)將玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜同時(shí)放大2 000、5 000和10 000倍時(shí)，觀察到了相同的結(jié)果，尤其是10 000倍可以看到玉米醇溶蛋白表面有一系列不規(guī)則大小的孔洞，zein－MS膜表面沒(méi)有孔隙，結(jié)構(gòu)較光滑，但表面有深有淺，有凹陷，平整度略差。上述結(jié)果證明孔洞等缺陷是導(dǎo)致膜機(jī)械性能差的主要原因，即對(duì)膜的抗拉強(qiáng)度造成一定的影響。玉米醇溶蛋白經(jīng)過(guò)麥芽糖漿濕熱法糖基化改性，麥芽糖漿分子和玉米醇溶蛋白分子發(fā)生共價(jià)接合，使膜的孔洞結(jié)構(gòu)消失，消失的孔洞彌合時(shí)，使膜表面形成稍微的凹陷，提高了膜的機(jī)械性能。

圖5 玉米醇溶蛋白膜和zein－MS膜表面的SEM圖

表1 檢測(cè)指標(biāo)

2.6 膠囊殼的制備

對(duì)改性后zein－MS進(jìn)行溶膠，利用圖6所示的1號(hào)膠囊模具蘸膠制備出圖7所示的硬膠囊殼，按照《中華人民共和國(guó)藥典(2015版)》的標(biāo)準(zhǔn)在膠囊體和膠囊帽的外觀、松緊度、脆碎度、干燥失重、灼燒殘?jiān)M(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

圖6 1號(hào)膠囊模具

圖7 自制的膠囊殼

由表1可知，按照《中華人民共和國(guó)藥典(2015版)》的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，由玉米醇溶蛋白制備的膠囊殼由于脆性較大，膠囊殼在脫模過(guò)程中膠囊殼會(huì)有裂痕，甚至易碎、不完整，在外觀、松緊度、脆碎度和干燥失重等方面不合格。由zein－MS制備膠囊殼的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，膠囊外觀沒(méi)有裂縫，無(wú)漏粉現(xiàn)象，表面光滑，質(zhì)地均勻。另外膠囊其他指標(biāo)，如松緊度、灼燒殘?jiān)?、脆碎度和干燥失重均合格。說(shuō)明經(jīng)濕熱法糖基化改性后，可有效改善玉米醇溶蛋白的脆性，制備膠囊殼符合國(guó)家藥典的指標(biāo)，為植物蛋白替代動(dòng)物明膠植物膠囊殼提供參考。

3 結(jié)論

玉米醇溶蛋白膜因其特殊的氨基酸組成，具有良好的成膜性，然而該膜脆性大，限制了它的應(yīng)用，尤其是在食品和藥品中的應(yīng)用。糖基化改性是一種降低玉米醇溶蛋白膜脆性，提高機(jī)械性能的有效方法。本研究以食品級(jí)的糖原麥芽糖漿為原料，通過(guò)濕熱法糖基化改性得到新的共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)產(chǎn)物zein－MS，該產(chǎn)物穩(wěn)定性好，具有一定的抗拉強(qiáng)度，有效改善玉米醇溶蛋白膜的脆性，增強(qiáng)了機(jī)械性能，而且改性過(guò)程中和改性后沒(méi)有有害化學(xué)試劑殘留，安全性好，適合替代明膠制備膠囊殼。