成小芳 王金明 趙陽飛 李妍妍 張耀文 張仙紅

(山西農業(yè)大學農學院1，太谷 030801)

(山西農業(yè)大學文理學院2，太谷 030801)

(山西農業(yè)大學動物科技學院3，太谷 030801)

(山西省農業(yè)科學院作物研究所4，太原 030000)

綠豆(Vigna radiata L.)在我國廣泛種植，其栽培面積、總產量和出口量均居世界前列，作為我國傳統(tǒng)主要食用豆類廣泛應用于食品、釀造和醫(yī)藥等工業(yè)［1］。但在綠豆儲藏期極易受到綠豆象(Callosobruchus chinensis L.)的危害，嚴重影響其產量和質量［2］。隨著雜交技術和轉基因工程技術的發(fā)展，國內外學者成功的將野生種的抗蟲成分或外源抗蟲基因轉入栽培種以減少昆蟲侵害，已成為一項廣泛應用的技術［3］。我國學者將來源于廣西野生稻的抗褐飛虱基因利用雜交轉育的方法培育出抗蟲水稻品種［4－5］;將抗蟲基因蘇云金芽桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)轉入水稻、玉米等作物中以減少病蟲的危害［6－7］。其中晉綠豆7號是通過山西省品種審定委員會認定以抗豆象的野生綠豆資源TC 1966為親本培育的高抗豆象品種［8］，主要是通過抑制綠豆象幼蟲體內消化酶、保護酶及解毒酶的活力從而起到抗綠豆象的作用［9］。但是要進行廣泛種植并食用或進入商業(yè)市場必須進行安全性評價。

具有抗蟲作用的晉綠7號綠豆是否會對人類的健康造成威脅尚不明確。目前，GB 15193—2014《食品安全性毒理學評價程序和方法》中應用小鼠亞慢性毒理學實驗是國內外對食用作物安全性評價的主要方法。故本研究以不同比例的抗綠豆象綠豆晉綠7號和感綠豆象綠豆濰綠2117作為小鼠飼料，對昆明小鼠進行60 d的喂養(yǎng)實驗。觀察食用抗綠豆象綠豆后對小鼠生長性狀、血常規(guī)、血生化指標及組織結構變化并應用RT－PCR技術檢測肝臟、腎臟中與細胞凋亡相關基因的表達，評價其對小鼠的亞慢性毒性，旨在為抗蟲綠豆晉綠7號的食用安全性和商業(yè)前景提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試綠豆

抗蟲綠豆晉綠7號、感蟲綠豆濰綠2117均由山西省農業(yè)科學院作物研究所提供。該實驗中抗蟲綠豆晉綠7號是 VC1973A與 TC1966雜交后代［8］，具有高抗綠豆象的特性，主產于山西省晉中市，5月中旬播種，8月下旬采收，自然風干密封后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器

TRIZOL試劑:大連寶生物工程有限公司;SYBR?PrimeScriptTM RT－PCR Kit試劑盒、DNA ladder maker:TaKaRa公司;Diethyl Pyrocarbonate(DEPC)、溴酚藍:Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

旋轉切片機:美國Thermo公司;生物顯微鏡:日本Olympus公司;Varioskan Flash全波長多功能酶標儀:美國Thermo公司;D－375高速冷凍離心機:德國Sigma公司;核酸蛋白測定儀:德國EP公司;凝膠成像系統(tǒng):美國Bio－Rad公司;DYY－7型轉移電泳儀:北京市六一儀器廠;MX3000P熒光定量PCR儀:美國Stratagene公司。

1.1.3 實驗動物

選擇21日齡斷奶昆明小鼠90只，購自山西醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心(動物合格證號SCXK(晉)2009－0001)，雌雄各半，體重18～24 g，適應1周后按照體重隨機分為5組，每組18只。動物飼養(yǎng)管理嚴格按照中華人民共和國科技部實驗動物管理規(guī)范，實驗期間所有小鼠采用自由采食和自由飲水的方式飼養(yǎng)，光周期12 L∶12 D，溫度22～25℃，濕度55% ～60%，定期更換墊料，保證良好的飼養(yǎng)環(huán)境，每天定量飼喂，確保每組小鼠采食量一致，每天飼喂3次，每3 d測定一次體重，實驗周期為15、30、60 d，按照3R原則給予人道的關懷。

1.1.4 飼料

實驗小鼠按體重隨機分為5組，分別為空白對照組(BK)、對照組(CK)、低劑量組(JL)、中劑量組(JM)和高劑量組(JH)。BK組飼料為普通飼料，由山西醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心提供;CK組飼料為60%普通飼料添加40%的感蟲綠豆濰綠2117，JL、JM和JH組的飼料分別為在普通飼料中分別添加抗蟲綠豆晉綠7號10%、20%、40%。將飼料按照表1配好后加水制作成顆粒飼料，烘干箱中烘干后按照每天5 g/只的標準進行飼喂小鼠。

表1 實驗小鼠日糧配方

1.2 方法

1.2.1 實驗動物小鼠生長狀況

飼養(yǎng)期間每天觀察實驗小鼠的精神狀態(tài)、生長發(fā)育情況和采食飲水狀況，小鼠體重每3 d稱量一次。

1.2.2 樣品的采集及前處理

小鼠分別于實驗第15、30、60天時禁食禁水24 h，每組隨機抽取6只(3雌、3雄)小鼠，摘眼球取血，3 000 r/min離心15 min分離血清并分裝在1.5 mL的EP管中 －20℃保存，用于血液生化指標測定。取血后迅速處死，取肝臟、腎臟放入液氮罐，最后統(tǒng)一放入超低溫冰箱－80℃保存，用于提取RNA并進行細胞凋亡分析。其余2只(1雌、1雄)進行心臟灌流，同時快速取肝臟、腎臟、脾臟、空腸置于10%的中性福爾馬林固定液固定，用于組織形態(tài)學檢查。

1.2.3 血清生化指標測定

血清中血鈣、堿性磷酸酶、白蛋白、甘油三酯、總膽固醇、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿酸、尿素氮、肌酐、血糖、總蛋白含量測定均嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用Varioskan Flash全波長多功能酶標儀讀取吸光度計算含量。

1.2.4 器官指數

1.2.5 組織形態(tài)學觀察

將飼養(yǎng)30 d的小鼠麻醉處死，取各組小鼠肝臟、腎臟、脾臟和空腸用10%的甲醛固定后，用不同梯度的酒精脫水，二甲苯透明2次，浸蠟過夜，石蠟包埋，置于旋轉切片機上連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，然后用溫水展片、撈片，烤干，蘇木精伊紅(HE)染色。生物顯微鏡下觀察其形態(tài)結構及病理情況。

1.2.6 晉綠7號綠豆對小鼠肝臟、腎臟凋亡相關基因的mRNA表達

1.2.6.1 總RNA的提取、cDNA的合成及質量鑒定

利用TRIZOL試劑提取肝臟、腎臟中的總RNA，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀對RNA進行檢測。置于 －82℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.6.2 熒光定量 RT－PCR引物設計與合成:由美國國立生物信息技術中心(NCBI)和Primer 3 Plus軟件設計小鼠 bax、bcl－2、Caspase－3和 cyt－c的基因序列和引物，同時以β－肌動蛋白(β－actin，Gen-Bank登錄號 NM_031144.3)為內參基因檢測和比較各RNA樣品的完整性及其反轉錄效率之間的差別，引物序列及大小見表2。

1.2.6.3 QRT－PCR反應體系及擴增條件的建立及數據處理

所有實驗RNA樣品的目的基因和內參基因擴增進行實時熒光定量PCR反應，使用兩步法進行，第一步為 RNA反轉錄為 cDNA(20 μL體系):Prime Script TM Buffer(5×)，4μL;總 RNA，2μL;RNase and Free dH20，14 μL。反轉錄條件:37.5 ℃ 10 min，90℃ 5 s。第二步為RT－PCR擴增(20 μL體系):SYBR Premix Ex TaqTM(2 × )，10 μL;PCR Forward Primer，0.8 μL;PCR Reverse Primer，0.8 μL;ROX Reference DyeⅡ(50 × )，0.4 μL;cDNA，2 μL;去離子水，6 μL。QRT－PCR 擴增條件:95℃ 10 s預變性;95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 5 s PCR 反應;95℃ 60 s，55℃ 30 s，95℃ 30 s溶解曲線繪制，QRT－PCR反應在MX3000P熒光定量PCR儀上進行，反應結束后軟件將自動進行數據分析，調整基線，計算出Threshold cycle(Ct值)。

表2 實驗中合成的引物序列

數據處理采用相對定量標準曲線法，根據Ct值計算目的基因在CK組和各實驗組的基因初始濃度，然后以β－actin為內參基因，計算其在CK組和各實驗組的基因初始濃度;相對表達量=(待測樣品目的基因初始濃度/待測樣品內參基因初始濃度)/(對照樣品目的基因初始濃度/對照樣品內參基因初始濃度)，以此公式計算實驗組目的基因相對于CK組的表達差異倍數。

1.2.7 數據統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行各組間ANOVA差異顯著性分析，Dunnett's(P＜0.05)多重比較進行檢驗，數值用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠生長狀況觀察

實驗期間BK組、CK組及實驗組小鼠均無死亡和中毒的臨床癥狀，食欲正常，生長發(fā)育良好，精神活潑反應靈敏，皮毛正常有光澤，尿液正常清亮，糞便顏色呈灰褐色顆粒。表明在受試期內抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠的生長發(fā)育未受到影響。

2.2 抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠體重的影響

抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠體重的影響見圖1，各組小鼠體重隨實驗時間的延長均呈上升趨勢。與BK組相比，在整個實驗期小鼠CK組及JL組體重有所升高，但均差異不顯著，表明在飼料中不添加綠豆或少量添加綠豆不會顯著改變小鼠體重。與CK相比，JM與JH組小鼠體重在實驗前期(前30 d)體重顯著降低，但實驗后期(后30 d)體重變化不顯著，表明短時間采食中、高劑量抗蟲晉綠7號綠豆對小鼠的體重增長有一定的抑制作用。

圖1 抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠體重的影響

2.3 抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠血清生化指標的影響

表3為抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠血清生化指標的影響。從小鼠血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶、血清鈣、葡萄糖、血清尿素氮和肌酐含量在實驗期內各實驗組均無顯著變化(P＞0.05)，表明抗蟲綠豆晉綠7號在受試劑量下對小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的肝臟、腎臟的毒性作用。

在實驗15 d時，各組小鼠甘油三酯濃度無顯著變化(P＞0.05);30 d時，BK組、JL組、JM組小鼠甘油三酯濃度與CK組相比均無顯著性差異，但JH組小鼠的甘油三酯濃度顯著降低(P＜0.05);60 d時，BK組、JL組與CK組相比均無顯著差異(P＞0.05)，JM組和JH組的甘油三酯濃度顯著低于CK組(P＜0.05)。小鼠血清總膽固醇濃度在整個實驗期與血清甘油三酯濃度呈一致的變化趨勢，與CK組相比，15 d時，只有JH組總膽固醇濃度顯著降低(P＜0.05);實驗30 d和60 d時，BK組、JL組的均無顯著變化，但JM組和JH組顯著低于CK組(P＜0.05)?？梢?，抗蟲綠豆晉綠7號在一定程度上可降低小鼠血液中甘油三酯和總膽固醇濃度，表明晉綠7號抗蟲綠豆對小鼠有一定的降脂作用。

表3 晉綠7號對小鼠血液生化指標的影響(n=6)

2.4 抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠器官發(fā)育的影響

實驗30 d時分別對小鼠6個實質性組織器官的外形進行觀察，未發(fā)現(xiàn)實質性組織器官的變形和病變，并對器官進行稱重計算器官指數(見表4)，與CK組相比，心、肝、脾、腎、肺、腦器官指數在JL、JM和JH組均無顯著變化(P＞0.05)，可見在實驗期抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠心、肝、脾、腎、肺、腦的發(fā)育未產生不良影響。

表4 實驗30 d后晉綠7號對小鼠器官指數的影響(n=6)

2.5 組織形態(tài)學觀察

實驗60 d時小鼠肝臟、脾臟、腎臟、空腸組織切片HE染色結果見圖2。CK組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞索和肝竇排列規(guī)則清晰，以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，肝細胞核仁大而圓，其他實驗組肝組織切片細胞分布均勻，細胞核完整，未見異?，F(xiàn)象。在脾臟組織中，CK組紅髓與白髓之間界限清晰，白髓內的淋巴小結結構清晰完整，生發(fā)中心明顯可見，而其他實驗組中脾臟組織結構同樣完整，淋巴細胞清晰可見，數量及結構未發(fā)現(xiàn)明顯改變。CK組小鼠腎臟組織結構正常，腎小管上皮細胞排列整齊有序，腎小球數量正常，結構清晰;其他實驗組小鼠腎臟結構未發(fā)生明顯的病理學改變，未看到腎小管管腔發(fā)生變窄及上皮細胞脫落等現(xiàn)象。表明抗蟲綠豆晉綠7號沒有導致小鼠肝、脾、腎組織發(fā)生病理學改變。

圖2 實驗60 d小鼠肝臟、脾臟、腎臟、空腸組織切片HE染色

從實驗60 d小鼠空腸組織切片可見，CK組小鼠空腸結構完整，隱窩深度及小腸絨毛長短正常，未發(fā)生腸腺細胞增生性病變;其他實驗組小鼠的空腸黏膜表面的紋狀緣結構層次清晰，腸絨毛排列整齊，細胞衣較厚，腸黏膜上皮細胞形狀規(guī)則，排列緊密，細胞核與細胞漿染色對比鮮明。表明晉綠7號未對小鼠腸道結構發(fā)生病理改變。

2.6 晉綠7號綠豆對小鼠肝臟、腎臟凋亡相關基因mRNA的表達

熒光定量PCR檢測肝臟、腎臟結果見圖3和圖4，實驗60 d時小鼠肝臟和腎臟凋亡相關基因bax、bcl－2、cyt－c及Caspase－3均無顯著差異，說明在實驗期內實驗劑量的晉綠7號對小鼠肝臟細胞和腎臟細胞的凋亡無促進作用。

圖3 肝臟凋亡相關基因表達水平測定結果

圖4 腎臟凋亡相關基因表達水平測定結果

3 討論

3.1 晉綠7號綠豆對小鼠生長發(fā)育的影響

在本實驗中，從肉眼觀察小鼠外觀及臨床表現(xiàn)各實驗組均正常，只有采食含抗蟲綠豆晉綠7號綠豆20%和40%的飼料前30 d的小鼠，其體重比CK組有所下降。而導致體重減輕的原因是多方面的，可能與抗蟲綠豆降低血液中膽固醇及甘油三酯的結果相關，這一結果與Chukwudebe等［10］報道大鼠采食含有33%的CV127大豆在實驗70 d和77 d時體重下降的結果相一致(其血糖在同期也顯著下降)。但Yao等［11］報道大鼠采含有65%的抗蟲綠豆90 d中體重無顯著變化(同期其血液生化指標均無改變)。具體導致小鼠體重下將的原因及機制尚不清楚，有待進一步深入探討。

3.2 晉綠7號綠豆對小鼠血液生化指標的影響

血清總蛋白是判定肝細胞合成蛋白質功能的有效指標，也是檢測腎臟重吸收功能的重要參考依據，血清白蛋白是肝臟合成的一種免疫球蛋白，二者是反映肝、腎功能的有效指標。本實驗血清總蛋白和白蛋白在所有實驗組中均沒有發(fā)生顯著改變，說明抗蟲綠豆晉綠7號沒有影響小鼠肝臟合成總蛋白及白蛋白的功能，但是否影響了肝臟及腎臟的其他功能還需結合血液學的其他生化指標綜合判定。本實驗中各實驗組小鼠的ALP沒有發(fā)生顯著變化，表明晉綠7號綠豆本身對骨骼生長沒有促進或抑制作用。但在實驗15 d時，各實驗組小鼠的堿性磷酸酶均高于30 d和60 d，這可能與小鼠在實驗前期生長發(fā)育較快，引起骨骼較快生長有關。這一結果分別與用轉基因稻谷［6］、CV127 大豆［10］、抗蟲綠豆［11］和轉基因玉米［12］飼喂大鼠的結果相一致，對小鼠骨骼、肝臟、腸道等組織器官沒有毒害作用。

本實驗結果表明，采食抗蟲綠豆的小鼠在實驗期血清ALT和AST濃度與對照相比均無顯著差異(P＞0.05)，表明抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠肝臟功能沒有損傷。這與用轉基因稻谷［6］和抗蟲綠豆中綠3號、4號、5號、6號［11］飼喂小鼠90 d后血清 ALT和AST也沒有發(fā)生變化相一致。

甘油三酯和膽固醇是體內能量的主要來源。在血液中，甘油三酯以脂蛋白的形式運輸，膽固醇主要與脂肪酸合成膽固醇酯存在于脂蛋白中。據報道，在十二指腸內pH為6.3時，綠豆可以結合膽汁酸和增加糞便分泌物的排泄來降低膽固醇［13－15］;研究表明用70%的綠豆粉混合于家兔飼料中飼喂家兔，既有預防和治療高血脂癥的作用，又有減輕冠狀動脈粥樣病變的功效［16］;將綠豆提取物混于飼料中喂養(yǎng)小鼠和大鼠7 d，發(fā)現(xiàn)綠豆具有明顯降低血清膽固醇的作用［17］。本實驗JM組和JH組的小鼠TG濃度和膽固醇濃度與對照相比均顯著下降(P＜0.05)，這可能是由于綠豆中所含的植物甾醇與膽固醇可同時競爭酯化酶，使之不能酯化而減少腸道對膽固醇的吸收有關。在本實驗中，添加不同劑量的抗蟲綠豆晉綠7號并未對小鼠的血鈣產生影響，這也印證了其他生化指標未變化的合理性。同時本研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲綠豆晉綠7號未對小鼠血糖產生影響，表明對肝臟合成和分解肝糖原不產生影響，對消化系統(tǒng)吸收碳水化合物提供血糖不產生負面影響，不會引起糖異生。這與前人對轉基因稻谷［6］、轉基因玉米［7，12］及轉基因大豆［10］的安全性評價結果相一致。

本實驗中，處理組小鼠血清尿素氮和肌酐含量均未發(fā)生顯著變化。這與用轉基因稻谷［6］和用抗蟲綠豆［11］飼喂小鼠后尿素氮和肌酐沒有發(fā)生改變的研究結果一致。表明抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠腎小球的濾過功能沒有影響，不會造成腎臟功能的損傷。

3.3 晉綠7號綠豆對小鼠臟器發(fā)育及組織形態(tài)的影響

本實驗中抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦的器官指數無顯著影響(P＞0.05)。這一結果與 Chukwudebe等［10］及 Yao等［11］分別用含有33%的CV127大豆飼喂大鼠及用抗綠豆象的中綠3號飼喂小鼠90 d后，心、肝、腦、脾、腎、胸腺等臟器系數均無顯著變化。表明小鼠臟器并不會由于食入含有抗蟲綠豆晉綠7號的飼料而發(fā)生改變。

張珍譽［6］采用檢查組織病理學方法對轉基因稻谷對小鼠的安全性進行評價，朱元招［18］用轉基因稻谷和大豆飼喂小鼠進行過組織病理學檢查均未發(fā)現(xiàn)組織器官發(fā)生病理學改變。本實驗選取處理組和CK組小鼠空腸、肝臟、腎臟和脾臟器官進行組織結構觀察比較，發(fā)現(xiàn)采食晉綠7號綠豆的小鼠空腸結構完整，腸絨毛排列整齊，空腸上皮細胞清晰可見，肝臟細胞排列整齊，結構完整，腎小球大小正常，脾臟淋巴細胞數量和形態(tài)均未見明顯變化，表明在實驗期內抗蟲綠豆晉綠7號沒有影響小鼠組織器官的結構及功能。這一結果也與血液生化指標的結果相符，與 CV127 大豆［10］、抗蟲綠豆［11］、轉基因稻谷［12］飼喂大鼠實驗中臟器的檢查結果相一致。

3.4 晉綠7號綠豆對小鼠肝臟、腎臟凋亡相關基因的影響

線粒體通路是目前被公認的動物細胞凋亡的主要機制之一。Anuradha等［19］指出，線粒體通路中bcl－2家族促凋亡蛋白bax、bcl－2會誘導線粒體膜間質凋亡蛋白(如細胞色素C，cyt－C)的釋放，與凋亡酶啟動子結合，活化凋亡酶啟動子后會進一步活化Caspase－3作為凋亡通路中效應型Caspases執(zhí)行細胞的凋亡，所以檢測Caspase－3的表達對線粒體凋亡通路至關重要。目前鮮有關于從組織器官的分子水平進行檢測食品安全性的研究。因此，本實驗從采食抗蟲綠豆小鼠線粒體通路中選擇肝臟、腎臟凋亡的相關基因進行檢測，結果顯示，采食晉綠7號綠豆的小鼠，其肝臟和腎臟中 bax、bcl－2、cyt－c及Caspase－3的基因表達均未發(fā)生改變，表明抗蟲綠豆晉綠7號對小鼠基因表達未產生影響，因此從分子水平上看對小鼠肝臟、腎臟也是安全的。

4 結論

采食晉綠7號抗蟲綠豆不會對小鼠生長發(fā)育、血液學指標及組織器官產生毒性作用，作為食用性食物可能不會對人類及動物造成危害，同時為晉綠7號的商業(yè)種植及食品安全性提供參考。