王麗萍 黃春來 陳小青 張 勇 邱妙華 莊永澤

代謝綜合征的發(fā)病率逐年增加，越來越多的研究表明代謝綜合征是導致和加重腎臟損害的危險因素[1-2]。因此研究代謝綜合征合并腎損害的病因、發(fā)病機制和防治策略非常重要。雙歧桿菌是腸道內主要的益生菌，與代謝綜合征、肥胖、2型糖尿病(T2DM)等代謝性疾病密切相關。眾多研究提示小檗堿具有調節(jié)腸道菌群，降低血糖、血脂，改善胰島素抵抗、代謝性內毒素血癥及全身慢性低度炎癥狀態(tài)等多種作用[3-6]。基于此，我們猜測小檗堿可能部分通過調節(jié)腸道雙歧桿菌數(shù)量發(fā)揮其對代謝綜合征腎損害的治療作用。故本文擬觀察小檗堿對代謝綜合征腎損害患者腸道雙歧桿菌和炎癥因子的影響，同時觀察患者相關指標的變化，以期得出小檗堿保護代謝綜合征腎損害患者的理論依據(jù)。

對象和方法

研究對象選取2016年1月至12月在福州總醫(yī)院腎內科經(jīng)臨床診斷符合代謝綜合征腎損害的患者20例，應用計算機生成隨機數(shù)字表方式隨機分成基礎組治療(對照組)和聯(lián)合小檗堿治療組(治療組)，每組各10例。其中對照組男性7例、女性3例，平均年齡(35.62±1.43)歲；治療組男性7例、女性3例，平均年齡(37.30±1.96)歲。同時選取性別、年齡相匹配的健康體檢者10例作為正常組。

納入標準(1)代謝綜合征的診斷：參照中華醫(yī)學會糖尿病分會(CDS) 2013標準[7]；(2)年齡18～60歲；(3)尿微量白蛋白/肌酐比值(U-mAlb/UCr)在30～200 mg/mmol；(4)血清肌酐(SCr)≤176.8 μmol/L；(5)腎損害出現(xiàn)在代謝綜合征之后；(6)漢族，無飲酒及吸煙史，飲食習慣以谷類、蔬菜和少量肉類為主；(7)愿意在我院接受治療和隨訪，并簽署知情同意書。

排除標準(1)對小檗堿過敏者；(2)12個月內使用糖皮質激素者；(3)在8周內使用腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑者；(4)糖尿病急性并發(fā)癥(包括糖尿病急性感染、糖尿病低血糖癥、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病高滲性昏迷及糖尿病乳酸性酸中毒)；(5)T1DM、妊娠糖尿病、特殊類型糖尿??；(6)急性腎損傷者；(7)妊娠或哺乳期婦女；(8)合并嚴重心、腦、肝和造血系統(tǒng)疾病及精神病患者;(9)腫瘤、傳染??；(10)合并慢性炎癥；慢性胃腸功能紊亂，近4周內腹瀉或其他胃腸道疾病史；(11)采樣前1月內服用抗生素、非甾體類藥物、益生元、益生菌和微生態(tài)制劑(如酸奶)人群；(12)有腸道手術及其他應激情況人群；(13)存在泌尿系或其他系統(tǒng)感染者。

退出標準(1)治療期發(fā)生不良事件，持續(xù)超過7天，無法繼續(xù)試驗：①丙氨酸轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)>正常值上限的2倍；②SCr>176.8 μmol/L；③白細胞<3.0×109/L或中性粒細胞<1.5×109/L；(2)研究者認為，嚴重違背方案(患者不能遵循研究流程及用藥要求、用藥依從性過低、擅自應用降低小檗堿療效的含鞣質的中藥)；(3)患者連續(xù)7天未按方案服用小檗堿(各種原因)；(4)治療過程中出現(xiàn)病情惡化，經(jīng)判斷須停止臨床試驗者；(5)患者在研究期間不愿繼續(xù)進行臨床試驗。(6)患者在受試過程中出現(xiàn)腹瀉、痢疾等胃腸道疾病，或者在受試過程中使用抗生素，經(jīng)判斷須停止臨床試驗者。

觀察指標和標本收集

觀察所有入選者的一般資料，包括血壓、身高、體重、腰圍、腹圍，并計算體質量指數(shù)(BMI)。常規(guī)方法檢測空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPBG)、空腹胰島素(FINS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、U-mAlb/UCr。

訪視當天留取空腹靜脈血液標本5 ml，低速離心分離出患者的上層血清(常溫，3 000 r/min，10 min)，放入-80℃冰箱保存。

訪視前一天20:00后禁食禁水，訪視當天清晨空腹留取清潔中段晨尿15 ml，低速離心分離上清液(常溫，3 000 r/min，5min)，放入-80℃冰箱保存。

留取訪視當天的糞便標本，用無菌4 ml Ep管收集，標本量應>2g(體積約占無菌Ep管一半以上)，并迅速置于-80℃冰箱保存。

檢測方法

血清及尿液白細胞介素6(IL-6)測定 采用ELISA法進行操作，所有操作嚴格按照試劑盒內所附說明書進行：準備、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、顯色、終止、測定。用ELISA Calc回歸/擬合計算程序，測吸光度OD值，繪制標準曲線，并計算出標準曲線的方程式，由方程式計算出樣品濃度。

糞便雙歧桿菌拷貝測定 采用QRT-PCR法進行操作:(1)稱取樣品0.2g于滅菌離心管，離心除去雜質，收集菌體。再嚴格按照DNA提取試劑盒的操作步驟，提取糞便總的DNA，最后檢測提取基因組的濃度，分裝后放入-20℃保存。(2)根據(jù)雙歧桿菌總菌16SrRNA基因序列，選用的引物序列為：上游引物5，-3，：GCGTGCTTAACACATGCAAGTC，下游引物5，-3，：CACCCGTTTCCAGGAGCTATT，進行PCR擴增?；厥盏腜CR產物進行TA克隆、電泳分析、提取質粒，最后進行QRT-PCR樣本檢測，得出雙歧桿菌的拷貝數(shù)。

統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，計量資料組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用組間方差分析，符合正態(tài)分布采用t檢驗，非正態(tài)分布采用秩和檢驗；相關性分析：符合正態(tài)分布的采用Pearson相關分析，非正態(tài)分布用Spearman相關分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

從上述分析可知，機械臂的承重性能與彈簧剛度、彈簧固定位置以及連桿的初始角度有關。為研究驗證機械臂的靜力學性能，利用ADAMS軟件對機械臂進行仿真試驗。將機械臂三維模型進行相應簡化，導入ADAMS軟件進行仿真研究。彈簧連桿機械臂仿真模型如圖5所示。

結 果

兩組患者基線資料治療組和對照組患者年齡、性別分布均無統(tǒng)計學差異。兩組干預治療前腹圍、腰圍、BMI、血壓、FBG、血脂、FINS、2hPBG、SCr、血清尿素氮及基礎治療情況均無統(tǒng)計學差異(表1)。所有患者均有超重和脂代謝紊亂，對照組6例合并糖代謝紊亂或糖尿病者，高血壓6例；治療組4例合并糖代謝紊亂或糖尿病者，高血壓7例。兩組基礎用藥情況(包括ACEI、ARB、調脂藥物和二甲雙胍等)無差異。

表1 各組治療前后一般指標的比較

BMI：體質量指數(shù)；FBG：空腹血糖；2hPBG:餐后2h血糖;FINS:空腹胰島素;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇；U-mAlb/Ucr：尿微量白蛋白/肌酐比值；T0:第0周；T1:第8周；#：與對照組T1比較，P<0.05；△：與同組T0比較，P<0.05

治療前后一般指標的比較與治療前比較，治療組患者8周后BMI、收縮壓、舒張壓、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C、U-mALb/Ucr均明顯下降(P<0.05)，對照組患者8周后收縮壓、舒張壓、U-mAlb/Ucr也明顯下降(P<0.05)；治療8周后，與對照組比較，治療組BMI、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C明顯下降(P<0.05)。兩組治療前后在腰圍、腹圍、HDL-C、TC及U-mAlb/Ucr比較上均無明顯差異性(P>0.05)(表1)。觀察期間兩組均無嚴重不良事件發(fā)生。

血清及尿液IL-6濃度的變化與正常組比較，對照組與治療組患者治療前血清IL-6、尿IL-6均明顯升高(P<0.05)；治療8周后，治療組患者血清IL-6、尿IL-6明顯下降(P<0.05)，而對照組未見明顯下降，兩組間比較有統(tǒng)計學意義(表2)。

腸道雙歧桿菌拷貝量的變化與正常組比較，對照組與治療組患者治療前腸道雙歧桿菌均明顯下降(P<0.05)；治療8周后，治療組患者腸道雙歧桿菌明顯升高(P<0.05)，而對照組未見明顯升高，兩組間比較有統(tǒng)計學意義(表3)。

表2 各組血清及尿液IL-6濃度的比較

IL-6：白細胞介素6；T0:第0周；T1:第8周；*：與正常組比較，P<0.05；#：與對照組T1比較，P<0.05；△：與T0比較，P<0.05

表3 各組腸道雙歧桿菌的比較(平均拷貝數(shù)×108/g)

T0:第0周;T1:第8周；*:與正常組比較，P<0.05；#:與對照組T1比較，P<0.05；△:與T0比較，P<0.05

腸道雙歧桿菌與血、尿IL-6水平的相關性采用Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征腎損害患者腸道雙歧桿菌與血清IL-6(r=-0.583；P=0.007)及尿IL-6(r=-0.843；P<0.001)均呈負相關關系(圖1)。

圖1 腸道雙歧桿菌與血、尿白細胞介素6(IL-6)的相關性

討 論

雙歧桿菌是人體腸道菌群中最常見的益生菌之一，參與宿主的新陳代謝、能量吸收、免疫防御及維持健康的腸道環(huán)境等，對人體健康發(fā)揮不可替代的作用。研究顯示腸道雙歧桿菌數(shù)量增加，可緩解內毒素血癥，改善糖代謝及慢性低度炎癥狀態(tài)，提示雙歧桿菌能夠通過調節(jié)腸道屏障來改善代謝綜合征[8]，亦有學者發(fā)現(xiàn)增加雙歧桿菌數(shù)量可緩解代謝綜合征中糖脂代謝異常[9]。Philippe等[10]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以誘導體重的減輕，影響代謝綜合征的多個組分。總之，越來越多的證據(jù)表明雙歧桿菌可能與慢性炎癥和代謝綜合征相關，其數(shù)量在一定程度上可反映機體的健康狀態(tài)。

IL-6是一種糖蛋白，除可被脂肪細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等分泌外，還可被腎臟系膜細胞、腎小管上皮細胞及腎臟毛細血管內皮細胞分泌。大量研究表明IL-6與胰島素抵抗(IR)密切相關，在IR狀態(tài)下，血清IL-6升高，且與胰島素敏感性相關[11]。已證實血清IL-6與FINS水平及T2DM的發(fā)展呈正相關[12]，而與代謝綜合征的其他組分如HDL-C、BMI呈明顯負相關[12-13]。

本研究結果顯示，代謝綜合征腎損害患者腸道雙歧桿菌拷貝數(shù)明顯低于正常組，血清IL-6顯著高于正常組；Spearman相關性分析顯示，腸道雙歧桿菌與血清IL-6水平呈直線性負相關，與既往研究一致，說明代謝綜合征合并腎損害患者腸道雙歧桿菌與健康人腸道內雙歧桿菌總菌數(shù)存在顯著差異，且存在低度炎癥狀態(tài)，并隨著雙歧桿菌拷貝數(shù)量的減少，炎癥狀態(tài)越明顯。雙歧桿菌作為腸道有益菌的一大類菌，近些年來大量研究發(fā)現(xiàn)肥胖、T2DM、代謝綜合征等代謝性疾病補充益生菌制劑后，可改善慢性低度炎癥等代謝性紊亂[14]。由此，我們推測代謝綜合征腎損害患者存在腸道菌群的紊亂，其特點是雙歧桿菌等有益菌的減少，導致了亞臨床炎癥狀態(tài)，進而造成腎臟損傷。但是具體通過哪條途徑造成的腎臟受損，需進一步研究。

近年來，已有明確臨床證據(jù)表明小檗堿能夠對代謝綜合征的多個組分發(fā)揮治療作用，如降低FBG、2hPBG、FINS及TG和LDL-C水平等，并且保護代謝綜合征的腎損傷[3]。李鑫等[4]用小檗堿灌胃治療高脂高糖喂養(yǎng)的T2MD大鼠后，發(fā)現(xiàn)小檗堿通過調節(jié)腸道菌群結構，可減少脂多糖(LPS)吸收入血，降低內毒素血癥?？党f等[5]研究顯示小檗堿可以調整腸道微生物，抑制條件致病菌的生長，減輕炎癥因子的生成。陳玲玲等給予T2DM患者小檗堿治療后，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高T2DM患者腸道雙歧桿菌數(shù)量，降低血漿LPS，并可降低空腹血糖及血脂[6]。

本研究顯示，代謝綜合征腎損害患者經(jīng)小檗堿治療后腸道雙歧桿菌明顯升高，血、尿IL-6水平明顯下降，而對照組治療前后無明顯差別，提示小檗堿可顯著增加腸道雙歧桿菌的拷貝量，與既往研究一致。因此，我們推測可能是因為其有調整腸道菌群的作用，減少了LPS入血，改善內毒素血癥，緩解對具有釋放促炎癥因子靶器官的刺激，從而對代謝綜合征腎損害發(fā)揮保護作用。

綜上可知，小檗堿可提高腸道雙歧桿菌數(shù)量，降低血、尿IL-6，改善患者糖脂代謝等，對臨床有一定治療作用。但因門診及住院相關代謝綜合征腎損害的病例少，故本研究仍存在一定的不足之處，包括樣本量偏少，隨訪周期有限，腸道菌群檢測指標僅限于雙歧桿菌等。有待進一步增加樣本例數(shù)、延長隨訪觀察周期，增加其他腸道菌群的研究，以更全面反映腸道菌群變化。