張清雯 陳 超 邵彥翔 趙亭亭

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

硒(Se)是生物必需的微量礦物元素，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和脫碘酶(DIO)的組成成分，硒可以利用還原的谷胱甘肽，將過(guò)氧化氫和脂肪酸過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水和脂肪酸，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷，在水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、免疫功能等方面有重要的作用[1-2]。硒代蛋氨酸(Se-Met)是有機(jī)硒的一種，是一定條件下由硒元素取代了蛋氨酸中同族的硫元素而合成[3]。與無(wú)機(jī)硒被動(dòng)擴(kuò)散的吸收方式不同，含硒氨基酸、酵母硒等有機(jī)硒在小腸通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞奖晃眨哂形湛?、利用率高、毒副作用小、環(huán)境污染少的特點(diǎn)[4]。有機(jī)硒在提高生長(zhǎng)速率、抗氧化能力、免疫力等方面的應(yīng)用廣受關(guān)注，作為飼料添加劑在畜禽應(yīng)用十分廣泛，但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中少有研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)用硒代蛋氨酸為L(zhǎng)-硒代蛋氨酸，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度為98%。

GPx、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活性，總抗氧化力(T-AOC)，總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物試劑研究所。免疫球蛋白M(IgM)含量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)飼料以酪蛋白和明膠為主要蛋白質(zhì)源，魚(yú)油和豆油為主要脂肪源，并添加礦物元素和多維配制而成。基礎(chǔ)飼料中硒代蛋氨酸的添加水平分別為0(對(duì)照組)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg，硒含量實(shí)測(cè)值分別為0.09(對(duì)照組)、0.21、0.44、0.58、0.77、1.05 mg/kg。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。所有飼料原料粉粹后過(guò)80目篩，采用逐級(jí)擴(kuò)大法混勻，加魚(yú)油和豆油搓勻至無(wú)油粒，加適量水?dāng)嚢韬笥脭D條機(jī)制成直徑為3 mm的顆粒飼料，于烘箱內(nèi)12 h烘干，分組裝袋并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets：VB175 mg，VB2200 mg，葉酸 folic acid 20 mg，VB650 mg，煙酸 niacin 500 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 300 mg，肌醇 inositol 1 000 mg，生物素 biotin 6 mg，VE 500 mg，VK 60 mg，VB121 mg，維生素A乙酸酯 VA acetate 15 mg，VD 0.05 mg，VC 200 mg。2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供 The mineral premix provided the following per kg of diets：FeSO4·H2O 8 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 2 g，ZnSO4·7H2O 30 g，MgSO4·7H2O 150 g，CaI20.5 g，CoSO4·7 H2O 0.1 g，KCl 70 g，沸石粉 zeolite powder 738.36 g。

試驗(yàn)用水為山東日照地下海水，pH為6.8～7.3，整個(gè)試驗(yàn)期水溫在18～24 ℃，海水鹽度為22‰～24‰，氨氮濃度小于0.2 mg/L。24 h不間斷充氣泵增氧，溢流水環(huán)境。每2周取海水檢測(cè)其中硒含量，試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到硒。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有魚(yú)饑餓24 h后，用100 mg/L的丁香酚輕微麻醉試驗(yàn)魚(yú)，對(duì)每個(gè)養(yǎng)殖桶中的魚(yú)計(jì)數(shù)、稱(chēng)重，計(jì)算增重率(WGR)和存活率(SR)。所有魚(yú)測(cè)完體重后，每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取5尾魚(yú)進(jìn)行尾靜脈取血，裝入1.5 mL離心管，然后放置在4 ℃冰箱中過(guò)夜，隨后3 000 r/min離心15 min，將所得血清分裝到1.8 mL凍存管中，暫存液氮罐中速凍，用于測(cè)定血清生化指標(biāo)和抗氧化酶活性。取腎臟、肝臟、肌肉用塑封袋分裝，于-20 ℃冰箱中保存，用于測(cè)定硒含量。每個(gè)養(yǎng)殖桶取5尾魚(yú)，丁香酚輕微麻醉后，取肝臟稱(chēng)重，計(jì)算肝體比(HSI)，然后取肌肉，用于測(cè)定肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分(粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、水分、粗灰分含量)。從每個(gè)養(yǎng)殖桶中另隨機(jī)取3尾魚(yú)，麻醉后置于冰盤(pán)上，取肝臟并混合放入冷凍管中，迅速放入液氮中，-80 ℃暫存，用于測(cè)定肝臟GPx、GR、GST、SOD、CAT活性和T-AOC。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

全魚(yú)和飼料中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定方法采用AOAC法。組織中硒含量采用氫化物原子熒光光譜法測(cè)定(GB/T 13883—2008)。肝臟和血清中抗氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒并使用多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3)測(cè)定。血清中LZM活性使用UV-2000型分光光度計(jì)測(cè)定，TP和IgM含量使用日立7020多功能生化分析儀測(cè)定。

生長(zhǎng)性能相關(guān)計(jì)算公式如下：

增重率(%)=[(魚(yú)體末重-魚(yú)體初重)/魚(yú)體初重]×100；存活率(%)=(試驗(yàn)魚(yú)終末尾數(shù)/試驗(yàn)魚(yú)初始尾數(shù))×100；飼料系數(shù)(FCR)=飼料攝食量/(終末均重-初始均重)；肝體比(%)=(肝臟重量/魚(yú)體重量)×100。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸生長(zhǎng)性能的影響

表2 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸生長(zhǎng)性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

圖1 飼料硒含量與增重率的二次曲線模型

2.2 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表3可知，各組之間肌肉水分和粗蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，肌肉水分含量為73.06%～77.32%，粗蛋白質(zhì)含量為21.53%～22.60%。隨著飼料硒含量的增加，肌肉粗脂肪含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肌肉粗脂肪含量最高，顯著高于除飼料硒含量為0.58 mg/kg組的其他各組(P<0.05)。飼料硒含量為0.44 mg/kg組的肌肉粗灰分含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.3 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸組織及血清硒含量的影響

由表4可知，各組肌肉和腎臟中硒含量沒(méi)有顯著差異(P<0.05)。肝臟中硒含量隨飼料硒含量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肝臟中硒含量顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21和0.44 mg/kg組(P<0.05)。血清中硒含量與飼料硒含量的關(guān)系與肝臟硒中含量趨勢(shì)相同，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清中硒含量最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21、0.44和1.05 mg/kg組(P<0.05)。對(duì)肝臟中硒含量進(jìn)行二次曲線分析，得出飼料中硒代蛋氨酸的適宜需求量為0.92 mg/kg(圖2)。

表4 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸組織及血清硒含量的影響

圖2 飼料硒含量和肝臟中硒含量的二次曲線模型

2.4 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清和肝臟中抗氧化酶活性的影響

由表5可知，血清GPx活性隨飼料硒含量的升高而升高，飼料硒含量為1.05 mg/kg組的血清GPx活性顯著高于其他各組(P<0.05)。血清GR活性隨飼料硒含量的升高呈先上升后降低的趨勢(shì)，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清GR活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.77和1.05 mg/kg組。血清CAT活性隨飼料硒含量的升高先升后降低，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清CAT活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21和1.05 mg/kg組(P<0.05)。各組之間血清SOD活性沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。血清GST活性隨飼料硒含量的升高先降低后升高，飼料硒含量為1.05 mg/kg組的血清GST活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21、0.44和0.58 mg/kg組(P<0.05)。

表5 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清中抗氧化酶活性的影響

由表6可知，肝臟GPx活性隨飼料硒含量的升高呈先上升后降低的趨勢(shì)，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GPx活性最低，顯著低于飼料硒含量為0.44、0.58和0.77 mg/kg組(P<0.05)。在飼料硒含量為0.09～0.58 mg/kg時(shí)，肝臟GR活性隨著飼料中硒含量的升高而升高，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GR活性最低，顯著低于飼料硒含量為0.44、0.58和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟GST活性隨著飼料硒含量的升高呈降低趨勢(shì)，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GST活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.44、0.58、0.77和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟SOD活性隨著飼料硒含量的升高先升高后降低，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肝臟SOD活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟CAT活性隨著飼料硒含量的升高呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，飼料硒含量為0.44 mg/kg組的肝臟CAT活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。各組之間的肝臟T-AOC差異不顯著(P>0.05)。

表6 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸肝臟中抗氧化酶活性的影響

2.5 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清生化指標(biāo)的影響

表7 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清生化指標(biāo)的影響

圖3 飼料硒含量和血清中溶菌酶活性的二次曲線模型

3 討 論

3.1 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸生長(zhǎng)性能的影響

3.2 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸組織和血清中硒含量的影響

3.3 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清和肝臟中抗氧化酶活性的影響

硒對(duì)生物機(jī)體的抗氧化主要是通過(guò)GPx等硒蛋白實(shí)現(xiàn)的。硒是GPx發(fā)揮活性作用必不可少的組分，在其活性中心有4個(gè)硒原子結(jié)合的硒代半胱氨酸，是氧化還原的中心。GPx是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，催化還原型谷胱甘肽(GSH)把體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物(ROOH)還原為無(wú)害的羥基化合物，并分解過(guò)氧化氫，從而阻斷活性氧自由基(ROS)對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷[36]。Behne等[37]研究表明，大鼠血漿、肝臟、腎臟和肌肉中GPx活性與硒含量顯著相關(guān)。GR是一種黃素蛋白氧化還原酶，以還原型輔酶Ⅱ?yàn)楣潴w，能催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH，對(duì)于維持生物體氧自由基的平衡起著重要作用[38]。在本試驗(yàn)中，血清中GPx活性隨著飼料中硒含量的增加呈線性升高，肝臟中GPx活性隨飼料硒含量升高先升高后降低，且與肝臟中硒含量積累相同，說(shuō)明組織內(nèi)高水平的硒可以誘導(dǎo)肝臟中GPx活性，增強(qiáng)機(jī)體防御自由基的能力。這與對(duì)石斑魚(yú)[30]、軍曹魚(yú)[34]的研究結(jié)果類(lèi)似。GST也是生物體內(nèi)的解毒酶，隨著飼料硒含量的升高，其活性降低。

SOD和CAT一起構(gòu)成機(jī)體的抗氧化防御體系，是細(xì)胞防御功能的第1道防線。有機(jī)硒對(duì)于魚(yú)類(lèi)抗氧化力的影響在石斑魚(yú)[30]、軍曹魚(yú)[34]、雜交鱧[39]的試驗(yàn)均有所研究。在正常條件下，超氧陰離子自由基(O2-·)可被SOD催化生成過(guò)氧化氫和氧氣，再由GPx和CAT分解成水[40]。本試驗(yàn)中，肝臟和血清中SOD活性均隨著飼料硒含量升高先升高后降低，與楊原志等[34]試驗(yàn)中硒代蛋氨酸組飼料對(duì)于軍曹魚(yú)的結(jié)果相同，與羅非魚(yú)[25]中血清SOD活性隨飼料硒含量先升后降的結(jié)果一致。肝臟中CAT活性隨飼料硒含量增加呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，添加硒代蛋氨酸的各組肝臟中CAT活性均高于對(duì)照組，與肝臟中SOD活性相同，說(shuō)明飼料中添加硒代蛋氨酸能夠提高機(jī)體抗氧化力。

3.4 硒代蛋氨酸對(duì)條紋鋸血清生化指標(biāo)的影響

4 結(jié) 論