張清雯 陳 超 邵彥翔 趙亭亭

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，青島 266071；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

硒(Se)是生物必需的微量礦物元素，是谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和脫碘酶(DIO)的組成成分，硒可以利用還原的谷胱甘肽，將過氧化氫和脂肪酸過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和脂肪酸，從而保護細胞膜免受氧化損傷，在水產(chǎn)動物生長性能、抗氧化能力、免疫功能等方面有重要的作用[1-2]。硒代蛋氨酸(Se-Met)是有機硒的一種，是一定條件下由硒元素取代了蛋氨酸中同族的硫元素而合成[3]。與無機硒被動擴散的吸收方式不同，含硒氨基酸、酵母硒等有機硒在小腸通過主動運輸?shù)姆绞奖晃眨哂形湛?、利用率高、毒副作用小、環(huán)境污染少的特點[4]。有機硒在提高生長速率、抗氧化能力、免疫力等方面的應用廣受關注，作為飼料添加劑在畜禽應用十分廣泛，但是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中少有研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗用硒代蛋氨酸為L-硒代蛋氨酸，購于上海源葉生物科技有限公司，純度為98%。

GPx、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活性，總抗氧化力(T-AOC)，總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量檢測試劑盒均購于南京建成生物試劑研究所。免疫球蛋白M(IgM)含量酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 試驗飼料

基礎飼料以酪蛋白和明膠為主要蛋白質(zhì)源，魚油和豆油為主要脂肪源，并添加礦物元素和多維配制而成。基礎飼料中硒代蛋氨酸的添加水平分別為0(對照組)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg，硒含量實測值分別為0.09(對照組)、0.21、0.44、0.58、0.77、1.05 mg/kg。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料粉粹后過80目篩，采用逐級擴大法混勻，加魚油和豆油搓勻至無油粒，加適量水攪拌后用擠條機制成直徑為3 mm的顆粒飼料，于烘箱內(nèi)12 h烘干，分組裝袋并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 試驗設計和飼養(yǎng)管理

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)維生素預混料為每千克飼料提供 The vitamin premix provided the following per kg of diets：VB175 mg，VB2200 mg，葉酸 folic acid 20 mg，VB650 mg，煙酸 niacin 500 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 300 mg，肌醇 inositol 1 000 mg，生物素 biotin 6 mg，VE 500 mg，VK 60 mg，VB121 mg，維生素A乙酸酯 VA acetate 15 mg，VD 0.05 mg，VC 200 mg。2)礦物質(zhì)預混料為每千克飼料提供 The mineral premix provided the following per kg of diets：FeSO4·H2O 8 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 2 g，ZnSO4·7H2O 30 g，MgSO4·7H2O 150 g，CaI20.5 g，CoSO4·7 H2O 0.1 g，KCl 70 g，沸石粉 zeolite powder 738.36 g。

試驗用水為山東日照地下海水，pH為6.8～7.3，整個試驗期水溫在18～24 ℃，海水鹽度為22‰～24‰，氨氮濃度小于0.2 mg/L。24 h不間斷充氣泵增氧，溢流水環(huán)境。每2周取海水檢測其中硒含量，試驗過程中沒有檢測到硒。

1.4 樣品采集

試驗結(jié)束時，所有魚饑餓24 h后，用100 mg/L的丁香酚輕微麻醉試驗魚，對每個養(yǎng)殖桶中的魚計數(shù)、稱重，計算增重率(WGR)和存活率(SR)。所有魚測完體重后，每個養(yǎng)殖桶中隨機取5尾魚進行尾靜脈取血，裝入1.5 mL離心管，然后放置在4 ℃冰箱中過夜，隨后3 000 r/min離心15 min，將所得血清分裝到1.8 mL凍存管中，暫存液氮罐中速凍，用于測定血清生化指標和抗氧化酶活性。取腎臟、肝臟、肌肉用塑封袋分裝，于-20 ℃冰箱中保存，用于測定硒含量。每個養(yǎng)殖桶取5尾魚，丁香酚輕微麻醉后，取肝臟稱重，計算肝體比(HSI)，然后取肌肉，用于測定肌肉基本營養(yǎng)成分(粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、水分、粗灰分含量)。從每個養(yǎng)殖桶中另隨機取3尾魚，麻醉后置于冰盤上，取肝臟并混合放入冷凍管中，迅速放入液氮中，-80 ℃暫存，用于測定肝臟GPx、GR、GST、SOD、CAT活性和T-AOC。

1.5 測定指標及方法

全魚和飼料中常規(guī)營養(yǎng)成分的測定方法采用AOAC法。組織中硒含量采用氫化物原子熒光光譜法測定(GB/T 13883—2008)。肝臟和血清中抗氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒并使用多功能酶標儀(SpectraMax iD3)測定。血清中LZM活性使用UV-2000型分光光度計測定，TP和IgM含量使用日立7020多功能生化分析儀測定。

生長性能相關計算公式如下：

增重率(%)=[(魚體末重-魚體初重)/魚體初重]×100；存活率(%)=(試驗魚終末尾數(shù)/試驗魚初始尾數(shù))×100；飼料系數(shù)(FCR)=飼料攝食量/(終末均重-初始均重)；肝體比(%)=(肝臟重量/魚體重量)×100。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 硒代蛋氨酸對條紋鋸生長性能的影響

表2 硒代蛋氨酸對條紋鋸生長性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

圖1 飼料硒含量與增重率的二次曲線模型

2.2 硒代蛋氨酸對條紋鋸肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，各組之間肌肉水分和粗蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異(P>0.05)，肌肉水分含量為73.06%～77.32%，粗蛋白質(zhì)含量為21.53%～22.60%。隨著飼料硒含量的增加，肌肉粗脂肪含量呈先降低后升高的趨勢，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肌肉粗脂肪含量最高，顯著高于除飼料硒含量為0.58 mg/kg組的其他各組(P<0.05)。飼料硒含量為0.44 mg/kg組的肌肉粗灰分含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 硒代蛋氨酸對條紋鋸肌肉營養(yǎng)成分的影響

2.3 硒代蛋氨酸對條紋鋸組織及血清硒含量的影響

由表4可知，各組肌肉和腎臟中硒含量沒有顯著差異(P<0.05)。肝臟中硒含量隨飼料硒含量的增加呈先升高后降低的趨勢，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肝臟中硒含量顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21和0.44 mg/kg組(P<0.05)。血清中硒含量與飼料硒含量的關系與肝臟硒中含量趨勢相同，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清中硒含量最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21、0.44和1.05 mg/kg組(P<0.05)。對肝臟中硒含量進行二次曲線分析，得出飼料中硒代蛋氨酸的適宜需求量為0.92 mg/kg(圖2)。

表4 硒代蛋氨酸對條紋鋸組織及血清硒含量的影響

圖2 飼料硒含量和肝臟中硒含量的二次曲線模型

2.4 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清和肝臟中抗氧化酶活性的影響

由表5可知，血清GPx活性隨飼料硒含量的升高而升高，飼料硒含量為1.05 mg/kg組的血清GPx活性顯著高于其他各組(P<0.05)。血清GR活性隨飼料硒含量的升高呈先上升后降低的趨勢，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清GR活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.77和1.05 mg/kg組。血清CAT活性隨飼料硒含量的升高先升后降低，飼料硒含量為0.58 mg/kg組的血清CAT活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21和1.05 mg/kg組(P<0.05)。各組之間血清SOD活性沒有顯著差異(P>0.05)。血清GST活性隨飼料硒含量的升高先降低后升高，飼料硒含量為1.05 mg/kg組的血清GST活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09、0.21、0.44和0.58 mg/kg組(P<0.05)。

表5 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清中抗氧化酶活性的影響

由表6可知，肝臟GPx活性隨飼料硒含量的升高呈先上升后降低的趨勢，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GPx活性最低，顯著低于飼料硒含量為0.44、0.58和0.77 mg/kg組(P<0.05)。在飼料硒含量為0.09～0.58 mg/kg時，肝臟GR活性隨著飼料中硒含量的升高而升高，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GR活性最低，顯著低于飼料硒含量為0.44、0.58和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟GST活性隨著飼料硒含量的升高呈降低趨勢，飼料硒含量為0.09 mg/kg組的肝臟GST活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.44、0.58、0.77和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟SOD活性隨著飼料硒含量的升高先升高后降低，飼料硒含量為0.77 mg/kg組的肝臟SOD活性最高，顯著高于飼料硒含量為0.09和1.05 mg/kg組(P<0.05)。肝臟CAT活性隨著飼料硒含量的升高呈先升高后降低再升高的趨勢，飼料硒含量為0.44 mg/kg組的肝臟CAT活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。各組之間的肝臟T-AOC差異不顯著(P>0.05)。

表6 硒代蛋氨酸對條紋鋸肝臟中抗氧化酶活性的影響

2.5 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清生化指標的影響

表7 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清生化指標的影響

圖3 飼料硒含量和血清中溶菌酶活性的二次曲線模型

3 討 論

3.1 硒代蛋氨酸對條紋鋸生長性能的影響

3.2 硒代蛋氨酸對條紋鋸組織和血清中硒含量的影響

3.3 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清和肝臟中抗氧化酶活性的影響

硒對生物機體的抗氧化主要是通過GPx等硒蛋白實現(xiàn)的。硒是GPx發(fā)揮活性作用必不可少的組分，在其活性中心有4個硒原子結(jié)合的硒代半胱氨酸，是氧化還原的中心。GPx是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，催化還原型谷胱甘肽(GSH)把體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物(ROOH)還原為無害的羥基化合物，并分解過氧化氫，從而阻斷活性氧自由基(ROS)對機體的進一步損傷[36]。Behne等[37]研究表明，大鼠血漿、肝臟、腎臟和肌肉中GPx活性與硒含量顯著相關。GR是一種黃素蛋白氧化還原酶，以還原型輔酶Ⅱ為供氫體，能催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH，對于維持生物體氧自由基的平衡起著重要作用[38]。在本試驗中，血清中GPx活性隨著飼料中硒含量的增加呈線性升高，肝臟中GPx活性隨飼料硒含量升高先升高后降低，且與肝臟中硒含量積累相同，說明組織內(nèi)高水平的硒可以誘導肝臟中GPx活性，增強機體防御自由基的能力。這與對石斑魚[30]、軍曹魚[34]的研究結(jié)果類似。GST也是生物體內(nèi)的解毒酶，隨著飼料硒含量的升高，其活性降低。

SOD和CAT一起構(gòu)成機體的抗氧化防御體系，是細胞防御功能的第1道防線。有機硒對于魚類抗氧化力的影響在石斑魚[30]、軍曹魚[34]、雜交鱧[39]的試驗均有所研究。在正常條件下，超氧陰離子自由基(O2-·)可被SOD催化生成過氧化氫和氧氣，再由GPx和CAT分解成水[40]。本試驗中，肝臟和血清中SOD活性均隨著飼料硒含量升高先升高后降低，與楊原志等[34]試驗中硒代蛋氨酸組飼料對于軍曹魚的結(jié)果相同，與羅非魚[25]中血清SOD活性隨飼料硒含量先升后降的結(jié)果一致。肝臟中CAT活性隨飼料硒含量增加呈先升高后降低再升高的趨勢，添加硒代蛋氨酸的各組肝臟中CAT活性均高于對照組，與肝臟中SOD活性相同，說明飼料中添加硒代蛋氨酸能夠提高機體抗氧化力。

3.4 硒代蛋氨酸對條紋鋸血清生化指標的影響

4 結(jié) 論