司丙文 徐文財 張小利 郭江鵬 刁其玉 屠 焰**

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，北京 100081；2.北京喬納森科技發(fā)展有限公司，北京 101309；3.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；4.北京市畜牧總站，北京 100029)

飼料資源短缺是制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一，大力開發(fā)綠色、優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟(jì)木本飼料資源對我國畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。構(gòu)樹[Broussonetiapapyrifera(L.)Vent.]又稱楮樹，?？浦参?，雌雄異株的落葉喬木，有的地方稱“皮樹”、“麻葉樹”、“醋桃樹”。雜交育種培育出的雜交構(gòu)樹具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐干冷、耐濕熱、根系發(fā)達(dá)、生物量大、耐刈割等特點(diǎn)。構(gòu)樹葉是優(yōu)質(zhì)的飼料原料，研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹葉中粗蛋白質(zhì)含量超過20%[1]，可與苜蓿媲美，富含氨基酸、維生素和微量元素，是一種極具開發(fā)價值的非常規(guī)林業(yè)蛋白質(zhì)飼料資源。構(gòu)樹也是一種傳統(tǒng)中草藥，構(gòu)樹葉中有多種黃酮類化合物、生物堿、多糖、不飽和脂肪酸等活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血壓、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老等藥理活性[2]。國務(wù)院扶貧辦將構(gòu)樹扶貧工程列入2015年我國十項精準(zhǔn)扶貧工程之一。近幾年，我國加大了規(guī)?；茝V雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)力度，“十三五”期間我國雜交構(gòu)樹種植面積將超過500萬hm2。在我國農(nóng)村長期以來就有用構(gòu)樹葉喂養(yǎng)豬、牛、羊的習(xí)慣，由于構(gòu)樹葉蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒有經(jīng)過生物發(fā)酵處理的構(gòu)樹葉畜禽食用后消化吸收利用率不高[3]。將全株雜交構(gòu)樹粉碎，添加不同添加劑發(fā)酵處理對雜交構(gòu)樹青貯效果的研究報道很少[4]。本文主要探討不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，為促進(jìn)雜交構(gòu)樹的大規(guī)模種植和綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青貯原料：2017年7月份采自北京市大興區(qū)人工種植的雜交構(gòu)樹，待株高長至1.6 m左右，利用青飼料收獲機(jī)進(jìn)行全株收割粉碎，留茬高度為15～20 cm，粉碎長度1～2 cm，pH 為7.35，其營養(yǎng)組成及微生物組成見表1。

糖蜜：糖蜜為制糖副產(chǎn)品，主要成分為蔗糖，紅褐色黏稠液體，干物質(zhì)含量50.01%，水溶性糖含量65.2%(干物質(zhì)基礎(chǔ)),購于徐州益邦環(huán)保科技有限公司。

酶菌復(fù)合制劑：主要成分為乳酸菌、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，粉末狀,購自寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司。

防腐劑：主要成分為丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺，液態(tài),購自德國愛德康集團(tuán)。

表1 雜交構(gòu)樹營養(yǎng)組成及微生物組成

FW:鮮重 fresh weight。

1.2 試驗設(shè)計與青貯方法

試驗共分5組，各組處理情況見表2。將各組所需青貯劑分別溶于200 mL蒸餾水中，充分?jǐn)噭蚝?，均勻噴灑?0 kg原料中，混合均勻，對照組添加等體積蒸餾水。每1 000 g原料裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)中，每個組3個重復(fù)，用真空封口機(jī)(型號DZ-280/2SD)抽真空封口，室溫貯藏60 d后開封取樣。在制作青貯時，取雜交構(gòu)樹原料樣品，帶回實驗室，-20 ℃保存待檢。

1.3 測定項目及其方法

1.3.1 營養(yǎng)成分分析

青貯飼料于60 ℃烘干48 h，過1 mm篩粉碎。干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量采用AOAC(1995)方法測定。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量采用范氏纖維素方法[5]測定。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)分析

青貯袋開啟后，準(zhǔn)確稱取20 g雜交構(gòu)樹青貯，加入180 mL蒸餾水中，用多功能攪拌機(jī)勻質(zhì)1 min。勻質(zhì)液用4層紗布過濾，用雷磁PHS-3C精密pH計測定濾液pH[6]。

濾液采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮含量[7]。添加了亞硝酸鈉和六亞甲基四胺的青貯中的氨態(tài)氮含量需要按這些添加劑能產(chǎn)生的最大的氨態(tài)氮潛能來校正[8]。如果用氨態(tài)氮含量占總氮的比例來表示蛋白質(zhì)水解度，未加校正的氨態(tài)氮含量會夸大蛋白質(zhì)的水解度[9]。

可溶性碳水化合物含量采用蒽酮-硫酸法[10]測定。

緩沖能采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[11]測定。

使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀(KC-811色譜柱；柱溫50 ℃；流速1 mL/min；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量為5 μL)分析乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[12]。

1.3.3 微生物分析

將5 g青貯樣品與45 mL無菌水混勻，在無菌水中做10-1～10-5系列梯度稀釋。使用平板涂布法進(jìn)行菌落培養(yǎng)。乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上、37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)48 h；酵母與霉菌在PDA培養(yǎng)基上、30 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)24 h；好氧細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上、30 ℃、好氧條件下培養(yǎng)24 h。以可見菌落數(shù)計[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行ANOVA分析，平均值間差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表2 試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前雜交構(gòu)樹主要營養(yǎng)成分和微生物組成

青貯前雜交構(gòu)樹主要營養(yǎng)成分及表面附著微生物組成見表1，青貯前雜交構(gòu)樹干物質(zhì)、水溶性碳水化合物及粗脂肪含量較低，分別為21.18% FW、4.18% DM和3.05% DM；粗蛋白質(zhì)含量和緩沖能值較高，分別為18.55% DM和502.13 mE/kg DM；構(gòu)樹葉表面附著的乳酸菌為4.51 log (CFU/g FW)，不足5 log (CFU/g FW)，而好氧細(xì)菌、酵母和霉菌的數(shù)量相對乳酸菌較多，分別為6.81和5.20 log (CFU/g FW)。

2.2 雜交構(gòu)樹青貯的營養(yǎng)成分

如表3所示，對照組的粗蛋白質(zhì)含量顯著低于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組的干物質(zhì)含量顯著高于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組和MTM組的粗蛋白質(zhì)及粗脂肪含量顯著高于其他3組(P<0.05)，M組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著低于其他各組(P<0.05)，粗灰分含量各組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯營養(yǎng)成分的影響

2.3 雜交構(gòu)樹青貯的發(fā)酵品質(zhì)

如表4所示，對照組pH顯著高于其他各組(P<0.05)，F(xiàn)FJ組的pH最低；與對照組相比，各組的乳酸含量均顯著提高(P<0.05)；M組的乙酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)；各組均未有丁酸檢出。FFJ組的氨態(tài)氮/總氮顯著低于其他各組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

本試驗中收割的雜交構(gòu)樹株高約1.6 m，枝葉幼嫩，干物質(zhì)含量較低。通常情況下，青貯原料中乳酸菌和水溶性碳水化合物含量越多，越容易青貯成功。一般來說，青貯原料上的乳酸菌數(shù)量至少要達(dá)到5 log (CFU/g FW)的水平[14]，才能更好地促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程。

表4 不同添加劑對雜交構(gòu)樹青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

雜交構(gòu)樹青貯原料表面附著的乳酸菌數(shù)量為4.51 log (CFU/g FW)，水溶性碳水化合物含量為4.18%，可見雜交構(gòu)樹青貯原料上附生的乳酸菌的數(shù)量較少，干物質(zhì)和水溶性碳水化合物含量低，粗蛋白質(zhì)含量較高，緩沖能高，屬于較難青貯原料。

在本試驗中，M組、TM組及MTM組與對照組相比，pH均有顯著降低，乳酸含量顯著提高，不同程度地提高了發(fā)酵品質(zhì)，各組中乳酸占總酸的比例高于70%，均表現(xiàn)為乳酸發(fā)酵類型，陳雷等[15]在全株玉米全混合日糧中添加乳酸菌顯著改善了發(fā)酵品質(zhì)，同時補(bǔ)充發(fā)酵底物葡萄糖、糖蜜可進(jìn)一步提高發(fā)酵品質(zhì)。同樣，Li等[16]在王草青貯中添加葡萄糖和糖蜜均顯著降低了pH，提高了乳酸含量。這與Lima等[17]的報道結(jié)果一致，主要是因為糖蜜和酶菌復(fù)合制劑的添加直接或間接為乳酸菌提供了更多的發(fā)酵底物或增加了乳酸菌的數(shù)量，從而產(chǎn)生了更多乳酸。

較高的緩沖能及較低的乳酸生成使得對照組的pH下降緩慢，從而未能有效抑制有害菌對蛋白質(zhì)的分解；加之原料本身高含水量和高蛋白質(zhì)含量，造成蛋白質(zhì)分解較強(qiáng)，因此對照組青貯過程中產(chǎn)生的氨態(tài)氮比較多。青貯飼料中氨態(tài)氮主要由植物酶對蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生[18-19]，氨態(tài)氮/總氮反映了青貯飼料蛋白質(zhì)降解的程度。M組、TM組和MTM組均保持較低的氨態(tài)氮/總氮，這可能是由于接種了乳酸菌或增加了發(fā)酵底物，產(chǎn)生更多乳酸，促進(jìn)了pH下降，進(jìn)而抑制了青貯過程中植物蛋白酶和微生物對蛋白質(zhì)和氨基酸的降解作用，減少了氨態(tài)氮的產(chǎn)生[20]。

FFJ組青貯中加入丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺組成的混合添加劑，丙酸鈉在酸性條件下產(chǎn)生游離丙酸，丙酸鈉在酸性介質(zhì)中對各類霉菌、好氧芽孢桿菌或革蘭陰性桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，六亞甲基四胺可水解為馬尿酸和甲醛，甲醛能使病原體蛋白質(zhì)變性而發(fā)揮非特異性抗菌作用，故FFJ組pH最低，丙酸占總酸的比例最高，蛋白質(zhì)降解少，干物質(zhì)保存最多。陳鵬飛等[9]在光葉紫花苕青貯中加入乳酸菌和由苯甲酸鈉、丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺組成的混合物，降低了pH和氨態(tài)氮的含量，提高了干物質(zhì)含量，這也與Lingvall等[21]的研究結(jié)果一致。

各組青貯中均沒有丁酸檢出，這可能與雜交構(gòu)樹本身富含黃酮類化合物有關(guān)。據(jù)報道，每千克構(gòu)樹葉提取物中含273 mg黃酮類物質(zhì)[22]，黃酮類化合物具有很好的抑菌作用，1.0%濃度的構(gòu)樹葉提取物的抑菌和防腐效果優(yōu)于濃度為0.1%的苯甲酸鈉，0.5%濃度及以上均可抑制細(xì)菌和霉菌生長，可見構(gòu)樹中含有黃酮類化合物是一種很好的天然防腐劑[23]。

3.2 添加劑對雜交構(gòu)樹青貯營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

青貯干物質(zhì)的損失始于植物細(xì)胞的呼吸作用，需氧微生物利用碳源產(chǎn)生水、熱量和二氧化碳，破壞分解養(yǎng)分；在構(gòu)樹青貯中添加丙酸鈉、亞硝酸鈉和六亞甲基四胺，能更快完成pH的下降過程，進(jìn)而抑制青貯過程中植物蛋白酶和微生物對蛋白質(zhì)和氨基酸的降解作用，減少干物質(zhì)損失，提高蛋白質(zhì)含量，同樣與對照組相比，添加酶菌復(fù)合制劑和糖蜜也顯著提高了粗蛋白質(zhì)的含量。董志浩等[24]在桑葉青貯中添加乳酸菌和發(fā)酵底物降低了氨態(tài)氮/總氮，提高了干物質(zhì)含量。同樣，張新平等[25]在苜蓿青貯中添加乳酸菌和纖維素酶，使青貯氨態(tài)氮含量顯著降低,并保存有較多的粗蛋白質(zhì)。

在青貯中添加纖維素酶有助于植物細(xì)胞壁的分解，使植物纖維成分含量下降，提高牧草的營養(yǎng)價值。Colombatto等[26]研究了纖維素酶的添加對微生物發(fā)酵的影響，其結(jié)果表明纖維素酶的增加有助于中性洗滌纖維的降解，這與本試驗中M組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量顯著低于對照組一致。也可能是由于較低的pH形成的酸性環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞壁成分的酸解作用。

4 結(jié) 論

本試驗中，在雜交構(gòu)樹青貯中添加糖蜜、酶菌復(fù)合制劑及防腐劑，在發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值方面均有明顯的改善；MTM組和FFJ組具有較低的pH，能更好地保存粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)，F(xiàn)FJ組效果最好。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)建議，在雜交構(gòu)樹青貯中添加糖蜜+酶菌復(fù)合制劑也能獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料。