郭昱含 楊勇智 郭賀楠 王 劍 曹云鶴

(中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

大豆、大豆產品及大豆加工副產品是人及動物重要的蛋白質來源，在食品和飼料領域有著廣泛的應用。大豆中含有多種抗營養(yǎng)因子如胰蛋白酶抑制劑、植酸、單寧和大豆寡糖等[1-2]，其中大豆寡糖中的棉籽糖和水蘇糖等α-半乳糖苷類寡糖，由于人和單胃動物體內缺少相應的水解酶α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,EC 3.2.1.22)，這些寡糖只能在后腸段被微生物發(fā)酵，這一過程中會產生CO2和甲烷等氣體，造成脹氣、腹痛、惡心和腹瀉等胃腸不適，影響營養(yǎng)物質的消化吸收，對人體健康和動物的生產性能造成負面影響。用α-半乳糖苷酶酶解是消除大豆寡糖抗營養(yǎng)因子的常用方法之一。

α-半乳糖苷酶又稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，能特異性水解α-半乳糖苷末端非還原性的α-1,6-半乳糖殘基，其可作用于含半乳糖的低聚寡糖如蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等，還可以作用于含半乳糖的多聚糖如半乳甘露聚糖和半乳糖脂等。α-半乳糖苷酶分布廣泛，咖啡豆等豆科植物的種子、番茄和煙草中均可分離得到α-半乳糖苷酶[3-5]，嗜熱細菌HB27、巨大芽孢桿菌、熱解纖維素菌、脆弱類桿菌、假交替單胞菌和天藍色鏈霉菌等細菌[6-11]，尖孢鐮刀菌、雙孢蘑菇、榆黃蘑和里氏木霉等真菌[12-15]以及人和鼠等哺乳動物[16-17]中也能分離得到α-半乳糖苷酶。

α-半乳糖苷酶在醫(yī)療、飼料、食品和造紙等行業(yè)都有廣泛的應用。在醫(yī)療領域中，α-半乳糖苷酶在法布里病的治療、血型轉換和異種器官的移植方面有重要應用，Alcalay等[18]的研究結果顯示α-半乳糖苷酶A與帕金森病有關聯。在飼料領域，外源添加α-半乳糖苷酶能夠有助于消除豆粕等飼料原料中大豆寡糖的抗營養(yǎng)作用，提高豬和家禽的生產性能，降低飼料成本[19-22]。在食品領域，α-半乳糖苷酶除了可以消除豆?jié){和豆奶中的大豆寡糖，還在制糖工業(yè)中有重要應用，能夠消除棉籽糖對蔗糖的妨礙作用，提高蔗糖得率[23]。此外，在造紙生產中組合使用α-半乳糖苷酶與木聚糖酶可以增強漂白效果[24]，α-半乳糖苷酶能夠與環(huán)糊精相互作用，生成的α-半乳糖-環(huán)糊精在一些重要的保健食品中有應用潛力。

米曲霉是糧食食品釀造和釀酒的主要菌種之一，在藥品制備、工業(yè)酶制劑和飼料生產上均有重要而廣泛的應用，被美國食品藥品監(jiān)督管理局列為公認安全的生物體(generally recognized as safe,GRAS)，可以發(fā)酵產生天門冬氨酰氨基肽酶、β-半乳糖苷酶、蛋白酶和角質酶等多種酶[25-28]。

本試驗組前期從北京市通州區(qū)的土壤中分離得到了1株產α-半乳糖苷酶的米曲霉，本試驗克隆了該米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因galA，依據畢赤酵母使用密碼子的偏好性進行基因序列的優(yōu)化，構建畢赤酵母工程菌株，搖瓶誘導表達研究其酶學性質，并驗證該酶對豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和載體

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)Top 10感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司，大腸桿菌克隆載體pGM-T、畢赤酵母表達載體pPICZαA、畢赤酵母X-33菌株均為本實驗室保存，米曲霉是從北京市通州區(qū)的土壤中分離得到(經過18S rRNA序列鑒定)。

1.1.2 工具酶及主要試劑

Phusion DNA聚合酶、EcoRⅠ和NotⅠ購自New England Biolabs公司，Zeocin購自Invitrogen公司，dNTPs和SacⅠ購自TaKaRa公司，對硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)購自Solarbio公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒和高純質粒小量制備試劑盒購自Omega公司，棉籽糖和蔗糖購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，半乳糖和水蘇糖購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米曲霉來源α-半乳糖苷酶基因galA的克隆與分析

以NCBI數據庫中公開的米曲霉來源α-半乳糖苷酶基因galA的mRNA序列(GenBank登錄號：XP_001817311.1)為依據，設計1對特異性引物galA-F(5′-ATGCGACTTATCACAAGATGGATACCGCTA-3′)和galA-R(5′-TTACAATGCGACATGGACACCAGCGGGTAA-3′)，以米曲霉總DNA為模板進行PCR擴增。PCR的反應條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后，取PCR產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增效果。將回收后的基因片段與載體pGM-T于16 ℃連接過夜后，轉入大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，重組質粒pGM-T-galA送至北京梓熙生物科技有限公司進行測序驗證，測序引物為galA-F和galA-R。序列結果用BioEdit軟件進行分析。

1.2.2 α-半乳糖苷酶基因galA畢赤酵母表達菌株的構建

以pGM-T-galA為模板，以EcoRⅠ-galA-F和NotⅠ-galA-R為引物，擴增質粒中的galA基因。引物序列如下：EcoRⅠ-galA-F，5′-CCGGAATTCATGCGACTTATCACAAG-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)，NotⅠ-galA-R，5′-ATTTGCGGCCGCTTACAATGCGACATG-3′(下劃線為NotⅠ酶切位點)。PCR的反應條件同1.2.1。用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ對PCR產物和載體pPICZαA進行雙酶切，置于37 ℃水浴酶切12 h后，將基因片段與載體于16 ℃連接過夜，轉入大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞。將重組表達質粒pPIC-galA-wt(wt表示野生型，下同)送至北京梓熙生物科技有限公司進行測序驗證，測序引物為AOX-F和AOX-R，序列結果用BioEdit軟件進行分析。

根據畢赤酵母使用密碼子的偏好性，對使用頻率低的密碼子進行替換，優(yōu)化galA的基因序列。優(yōu)化的合成和測序由北京梓熙生物科技有限公司完成。優(yōu)化后的表達載體pPIC-galA-opt(opt表示優(yōu)化型，下同)的構建方法同上。

將重組表達質粒pPIC-galA-wt和pPIC-galA-opt用限制性內切酶SacⅠ線性化。37 ℃酶切過夜后電轉入新配制的畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，電擊完成后立即加入1 mL冰預冷的1 mol/L的山梨醇溶液，充分混勻后轉移至50 mL離心管中，28 ℃培養(yǎng)3 h。將菌體懸液涂布于YPDS固體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)，28 ℃培養(yǎng)約3 d，直至長出清晰的菌落。挑取單菌落劃線至YPD固體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，至菌落清晰。

1.2.3 重組菌株的搖瓶發(fā)酵

挑取X33/galA-wt和X33/galA-opt單菌落，分別接種于10 mL的YPD液體培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Zeocin)中，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)約24 h，取100 μL的菌液至50 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)至600 nm波長下吸光度(OD600)達到2.0，將全部BMGY液體培養(yǎng)基以5 000 r/min、4 ℃離心10 min,棄掉上清，用50 mL的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體，250 r/min、28 ℃培養(yǎng)。每24 h向培養(yǎng)液中加無水甲醇(終濃度0.5%)進行誘導。120 h后，將菌液于常溫下12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于4 ℃保存。

1.2.4 α-半乳糖苷酶活性的測定

參照Rezessy-Szabó等[29]的方法進行α-半乳糖苷酶活性的測定。配制濃度分別為0、2、4、8、16、24、32和40 μmol/L的對硝基苯酚標準梯度溶液，測定溶液在405 nm波長下的吸光度(OD405)。以OD405為橫坐標，以對硝基苯酚的濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

取100 μL底物溶液pNPG(10 mmol/L)與100 μL用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當稀釋的酶液，55 ℃條件下反應10 min，加入800 μL的Na2CO3溶液(0.5 mol/L)終止反應，測定溶液的OD405。α-半乳糖苷酶活性的定義為：在55 ℃和pH 4.33的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的pNPG底物溶液中釋放1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為1個活性單位(U)。

1.2.5 α-半乳糖苷酶的酶學性質分析

最適pH：配制pH分別為2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，用上述不同pH的緩沖液稀釋酶液和配制10 mmol/L的pNPG底物溶液，在55 ℃條件下測定α-半乳糖苷酶活性。

pH穩(wěn)定性：在室溫下，將酶液分別在上述不同pH的緩沖液中預處理30 min，最適條件下測定殘余α-半乳糖苷酶活性。

最適溫度：分別在10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃下測定α-半乳糖苷酶活性，確定最適溫度。

溫度穩(wěn)定性：將酶液分別置于40和45 ℃保溫100 min，每20 min取樣；分別置于50 和55 ℃保溫50 min，每10 min取樣；置于60 ℃保溫12 min，每2 min取樣；置于65 ℃保溫10 min，每2 min取樣；置于70 ℃保溫5 min，每1 min取樣。每個溫度設置1個對照組，對照組的酶液置于4 ℃保溫，其余條件均與試驗組相同。處理后在最適條件下測定α-半乳糖苷酶活性。

金屬離子抗性：用最適pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制濃度為20 mmol/L的不同金屬化合物[CuSO4、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、CaCl2、ZnSO4、NaCl、CoSO4、NaNO3和MnSO4]溶液，將酶液與金屬化合物溶液等體積混合，使金屬離子終濃度為10 mmol/L。以不添加金屬離子的酶液作為空白對照。室溫下處理1 h后在最適條件下測定α-半乳糖苷酶活性。

酶動力學參數：用最適pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制濃度分別為1、10/9、5/4、10/7、5/3、2、5/2、10/3、5、10和20 mmol/L的pNPG底物溶液。在最適條件下測定α-半乳糖苷酶活性。根據Eadie-Hofstee作圖法測定米氏常數(Km)和最大反應速度(Vmax)。

1.2.6 α-半乳糖苷酶對豆?jié){中大豆寡糖的體外酶解效果分析

將自制的10%(質量體積分數)豆?jié){溶液以10 000 r/min離心15 min后取上清液，用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調節(jié)pH為5.00，作為反應液。取10 mL上述豆?jié){反應液于15 mL離心管中，按照以下條件設置進行試驗。試驗設置6個處理，分別是：1)加酶量0.6 U，溫度25 ℃；2)加酶量1.2 U，溫度25 ℃；3)加酶量2.4 U，溫度25 ℃；4)加酶量0.6 U，溫度45 ℃；5)加酶量1.2 U，溫度45 ℃；6)加酶量2.4 U，溫度45 ℃。每個處理設置2個平行1個對照，對照加入2 mL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.33)。在反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0和12.0 h時分別取樣500 μL，立即100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫后10 000 r/min離心10 min，用超純水將上清液稀釋500倍，過0.10 μm濾膜于接樣瓶中，進行離子色譜，分析其半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量的變化，并根據水蘇糖和棉籽糖含量的變化計算降解率。

2 結果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶基因gal A的PCR擴增及序列比對分析

以提取的米曲霉總DNA為模板，用特異性引物galA-F和galA-R來進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，在約1 600 bp處可見1條清晰的條帶，與預期結果相符。

M：DL-2000分子量標準；1：α-半乳糖苷酶基因gal A PCR擴增產物。

PCR產物與大腸桿菌克隆載體pGM-T連接后轉化到大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆進行測序。序列分析結果表明，PCR擴增得到的DNA片段為目的基因，基因全長1 605 bp，不含內含子，編碼534個氨基酸，包含25個氨基酸的信號肽，有2個天冬氨酸催化位點，預測蛋白質的等電點為4.57(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)，屬于糖基水解酶27(GH27)家族。

將該基因與NCBI上已知序列進行比對，結果見圖2。本試驗中米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因galA與2種已報道的米曲霉來源的α-半乳糖苷酶基因(NCBI參考序列：XP_001817311.1；GenBank登錄號：OOO13450.1)的序列一致性為100%，但關于這2種酶的酶學性質并沒有報道。

米曲霉 Aspergillus oryzae(GenBank登錄號：OOO13450.1)；米曲霉RIB40 Aspergillus oryzae RIB40(NCBI參考序列：XP_001817311.1)；黃曲霉NRRL3357 Aspergillus flavus NRRL3357(NCBI參考序列：XP_002372370.1)；黃曲霉AF70 Aspergillus flavus AF70(GenBank登錄號：KOC13641.1)；寄生曲霉SU-1 Aspergillus parasiticus SU-1(GenBank登錄號：KJK61669.1)；Aspergillus arachidicola(GenBank登錄號：PIG89641.1)；Aspergillus bombycis(NCBI參考序列：XP_022394533.1)；黑曲霉ATCC1015 Aspergillus niger ATCC1015(GenBank登錄號：EHA18663.1)；黑曲霉 Aspergillus niger(GenBank登錄號：SPB52066.1)；黑曲霉 Aspergillus niger(UniProtKB/Swiss-Prot：P28351.1)。

2.2 α-半乳糖苷酶基因序列的優(yōu)化

根據畢赤酵母使用密碼子的偏好性，以不改變氨基酸序列為前提，對去除信號肽的α-半乳糖苷酶基因序列進行優(yōu)化，優(yōu)化前后的序列比較見圖3，galA-wt與galA-opt核苷酸序列的一致性為76.68%。

黑色陰影為野生序列與優(yōu)化序列一致部分。

2.3 畢赤酵母工程菌株的搖瓶表達

將構建好的野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株進行搖瓶發(fā)酵，結果見表1。由表中數據可以發(fā)現，在發(fā)酵最初的48 h，野生型和優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性均快速提高，隨后增速減緩。在搖瓶發(fā)酵全過程中，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性始終高于野生型工程菌株。誘導120 h后，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株搖瓶表達產物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖見圖4。將目的條帶切下進行質譜鑒定，鑒定結果顯示搖瓶發(fā)酵產物確為α-半乳糖苷酶。

表1 重組菌株搖瓶發(fā)酵活力

M：分子量標準；1～3：優(yōu)化型工程菌株；4～6：野生型工程菌株。

2.4 α-半乳糖苷酶的酶學性質分析

2.4.1 最適pH和pH穩(wěn)定性

55 ℃條件下，測定α-半乳糖苷酶在pH 2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的活性，結果顯示，α-半乳糖苷酶活性最大值出現在pH 3.00～5.00間。因此，在pH 3.00～5.00間再設置梯度，55 ℃條件下再次測定α-半乳糖苷酶在pH 2.00、3.00、3.33、3.66、4.00、4.33、4.66、5.00、6.00、7.00和8.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的活性，結果顯示，該酶的最適pH為4.33，當pH在3.33～5.00間時可保持60%以上的相對活性(圖5)。

室溫下，將酶液在不同pH的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中預處理30 min后，在最適條件下測殘余α-半乳糖苷酶活性，結果如圖6所示，該酶在pH 3.00～8.00的條件下穩(wěn)定性良好，在pH 2.00條件下處理30 min后，仍保持60%的相對活性。

圖5 pH對α-半乳糖苷酶活性的影響

2.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在pH 4.33的條件下，分別于10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75和80 ℃的溫度下測定α-半乳糖苷酶的活性，結果顯示，α-半乳糖苷酶的最適溫度為55 ℃。當溫度低于55 ℃時，該酶的活性隨溫度的升高而逐漸增加；當溫度超過55 ℃時，該酶的活性則隨溫度的升高而下降。當溫度在40～60 ℃間時，該酶的相對活性可保持在50%以上(圖7)。

圖8顯示的是α-半乳糖苷酶活性的溫度穩(wěn)定性，該酶在40和45 ℃條件下預處理100 min，活性幾乎不變；在50 ℃條件下預處理50 min，活性幾乎不變；在55 ℃條件下預處理50 min后殘余α-半乳糖苷酶的相對活性約為50%；當溫度超過60 ℃時，短時間內α-半乳糖苷酶即可失活。

圖6 α-半乳糖苷酶活性的pH穩(wěn)定性

圖7 溫度對α-半乳糖苷酶活性的影響

圖8 α-半乳糖苷酶活性的溫度穩(wěn)定性

2.4.3 金屬離子抗性

從表2可知，MnSO4對α-半乳糖苷酶的活性有較強的抑制作用，而KCl、(NH4)2SO4和CuSO4則可提高α-半乳糖苷酶的活性。其他金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響不明顯。

表2 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

2.4.4 酶動力學參數

以pNPG為底物，用Eadie-Hofstee作圖法測定Km和Vmax，結果如圖9所示。可知，該酶的Km為0.024 3 mol/L，Vmax為1.0×10-7mol/(L·s)。

v：平均反應速率[mol/(L·s)]；[S]：底物濃度(mol/L)。

2.5 α-半乳糖苷酶對豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

設置不同的溫度和不同加酶量，驗證α-半乳糖苷酶對豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果。對酶解產物進行離子色譜分析，根據各組分的保留時間采用外標法對峰面積積分，得出各組分的含量。記錄結果，分析并計算各處理條件下棉籽糖和水蘇糖隨酶解時間的增加其含量的變化。結果顯示，在25 ℃條件下，3個加酶量處理下棉籽糖和水蘇糖的含量均幾乎不變，在45 ℃條件下，3個加酶量處理下中棉籽糖和水蘇糖的含量有所減少，且加酶量大的處理減少的更多，反應12 h后，加酶量為1.2 U的處理棉籽糖降解率為4.8%，水蘇糖降解率為8.0%，加酶量為2.4 U的處理棉籽糖降解率達到50.0%，水蘇糖降解率達到31.9%。

3 討 論

3.1 α-半乳糖苷酶基因序列的優(yōu)化

畢赤酵母是一種常用的外源蛋白質表達系統，其對密碼子具有偏好性，當序列中出現較多的稀有密碼子時，表達效率可能表現出明顯的降低，甚至導致翻譯提前終止，蛋白質表達受阻。因此，研究中通常根據畢赤酵母使用密碼子的偏好性，用常用的密碼子替換稀有密碼子，對基因序列進行優(yōu)化，可以明顯提高蛋白質的表達水平。Chang等[30]根據畢赤酵母密碼子偏好性對皺落假絲酵母脂肪酶基因序列進行了優(yōu)化，結果表明優(yōu)化后的脂肪酶蛋白質表達量為152 mg/L，是野生型(33 mg/L)的4.6倍。在本試驗中，根據畢赤酵母使用密碼子的偏好性，以不改變氨基酸序列為前提，對去除信號肽的α-半乳糖苷酶基因序列進行優(yōu)化，galA-wt與galA-opt核苷酸序列的一致性為76.68%。優(yōu)化型和野生型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株同時發(fā)酵120 h，在發(fā)酵過程中優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性高于野生型工程菌株，在發(fā)酵結束時優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。

3.2 α-半乳糖苷酶的酶學性質分析

來源不同，α-半乳糖苷酶的酶學性質也各不相同。真菌來源的α-半乳糖苷酶最適pH通常在4～6，最適溫度一般在40～70 ℃。Katrolia等[31]對米黑根毛霉α-半乳糖苷酶基因進行克隆并在大腸桿菌中表達，結果顯示，其α-半乳糖苷酶基因開放閱讀框為2 256 bp，編碼751個氨基酸，最適pH和最適溫度分別為4.5和60 ℃。Rezessy-Szabó等[29]對疏棉狀嗜熱絲孢菌CBS 396.62/b中的α-半乳糖苷酶進行研究，顯示該酶的最適pH為5.0～5.5，最適溫度為65 ℃。本試驗中，米曲霉來源的α-半乳糖苷酶在pH 4.33和溫度55 ℃條件下相對活性最大。在實際生產中，對酶的穩(wěn)定性特別是溫度穩(wěn)定性要求較高，對酶熱穩(wěn)定性的研究也逐漸增多。Aulitto等[6]報道的產耐熱性α-半乳糖苷酶的菌株嗜熱細菌HB27的最適溫度為90 ℃，在70 ℃下6 h后殘余α-半乳糖苷酶相對活性高達90%，30 h后仍可達50%，在90 ℃下保持1 h后殘余α-半乳糖苷酶相對活性約為50%。

本試驗中研究的α-半乳糖苷酶具有較好的pH穩(wěn)定性，在pH 3.00～8.00的條件下處理30 min活性幾乎不變，在pH 2.00條件下處理30 min后，仍保持60%的相對活性。溫度穩(wěn)定性方面，該酶在溫度低于55 ℃時穩(wěn)定性較高，在55 ℃條件下50 min后殘余α-半乳糖苷酶相對活性為50%，當溫度為60 ℃時，10 min后α-半乳糖苷酶的活性損失接近1/2，70 ℃條件下5 min后α-半乳糖苷酶即完全失活。此外，本試驗得到的α-半乳糖苷酶對試驗中的大部分金屬離子的抗性較好，而MnSO4對α-半乳糖苷酶的活性有較強的抑制作用，KCl、(NH4)2SO4和CuSO4則可提高α-半乳糖苷酶的活性。

3.3 α-半乳糖苷酶對豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

α-半乳糖苷酶酶解大豆寡糖屬于消除大豆寡糖抗營養(yǎng)作用的生物學方法。Huang等[32]將巨大芽孢桿菌來源的α-半乳糖苷酶在大腸桿菌中進行表達，其最適溫度為37 ℃，最適pH為6.8，向1 mL豆?jié){中加入1 U/mL該酶或者該酶與胰蛋白酶的混合物，37 ℃條件下進行酶解，可有效降解豆?jié){中的棉籽糖和水蘇糖，且α-半乳糖苷酶與胰蛋白酶同時存在時更利于大豆寡糖的降解，4 h內即可完全降解豆?jié){中的棉籽糖和水蘇糖。在本試驗中，用發(fā)酵所得的粗酶液超濾掉金屬離子后進行豆?jié){中大豆寡糖的酶解，設置2個溫度(25和45 ℃)和3個加酶量(0.6、1.2和2.4 U)，對10 mL豆?jié){(調節(jié)pH為5.00)進行酶解。較低溫度(25 ℃)條件下豆?jié){中棉籽糖和水蘇糖的含量幾乎不變，較高溫度(45 ℃)與最高加酶量(2.4 U)條件下酶解12 h，棉籽糖和水蘇糖的降解率分別為50.0%和31.9%。與其他大豆寡糖降解試驗的結果相比，本試驗中棉籽糖和水蘇糖的降解效率低且降解效果差，造成這一現象的原因可能有：1)豆?jié){的pH為6.30[33]，本試驗中α-半乳糖苷酶的最適pH為4.33，pH穩(wěn)定性表明該酶在pH 3.00～8.00的條件下室溫處理30 min后保持大約90%的相對活性，且pH為5.00時的穩(wěn)定性好于pH為6.00時(相對活性分別為103%和99%)，由于酶解反應持續(xù)時間長，為了讓酶在反應過程中保持更好的穩(wěn)定性，選擇用pH 4.33的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調節(jié)豆?jié){pH為5.00后再加酶進行反應。已有的α-半乳糖苷酶酶解豆?jié){的研究中，或者選擇酶的最適pH為反應條件[32]，或者直接向豆?jié){中加入酶液[33-34]，棉籽糖和水蘇糖均被完全降解。本試驗中選擇的pH條件不合適，可能導致α-半乳糖苷酶的活性被抑制，無法發(fā)揮酶解作用。2)反應體系不合適。本試驗中加酶量較低，需要降解的豆?jié){體系較多，反應過程中酶與底物接觸不充分，導致酶解不充分。3)本試驗中25 ℃條件下棉籽糖和水蘇糖幾乎沒有被降解，這可能是低溫下α-半乳糖苷酶活性受到抑制，也可能與大豆中其他抗營養(yǎng)因子的抑制作用有關。

4 結 論

① 本試驗克隆出了米曲霉來源α-半乳糖苷酶galA基因序列，該基因全長1 605 bp，不含內含子，編碼534個氨基酸，含有1個25個氨基酸長度的信號肽；構建了野生型和優(yōu)化型α-半乳糖苷酶畢赤酵母工程菌株，搖瓶發(fā)酵120 h后α-半乳糖苷酶活性分別為0.507和1.952 U/mL，優(yōu)化型工程菌株的α-半乳糖苷酶活性比野生型工程菌株提高了285%。

② 本試驗中生產的α-半乳糖苷酶的最適pH為4.33，最適溫度為55 ℃，有較好的金屬離子抗性，以pNPG為底物進行酶動力學參數的測定，該酶的Km為0.024 3 mol/L，Vmax為1.0×10-7mol/(L·s)。

③ 用本試驗中生產的α-半乳糖苷酶進行豆?jié){中大豆寡糖的體外酶解試驗，當溫度為45 ℃、加酶量為2.4 U時，反應12 h后棉籽糖的降解率為50.0%，水蘇糖的降解率為31.9%，降解效果較好，該α-半乳糖苷酶對降解大豆寡糖具有潛力。