黃欽成 聶家全 董曉慧* 譚北平 遲淑艷 楊奇慧 劉泓宇 章 雙 楊原志 張海濤

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，湛江 524088；2.農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點實驗室，湛江 524000)

鈷(Co)是銀白色鐵磁性金屬，在周期表中屬Ⅷ族，屬于鐵族元素，理化性質(zhì)與鐵、鎳接近，是動物的一種必需微量礦物元素。維生素B12因含Co又稱鈷胺素，其生物功能主要有促進紅細(xì)胞成熟和發(fā)育、脂肪酸代謝、高半胱氨酸的甲基化、正常葉酸循環(huán)，維生素B12缺乏常導(dǎo)致葉酸缺乏癥[1]。已有研究證明，Co可以促進動物胃腸道微生物合成維生素B12來維持魚類正常生長的需要，從而彌補飼料中維生素B12的不足[2]。另外，Co在增強血紅素的分解代謝、動物抗氧化活性和抑制炎癥反應(yīng)上也有重要作用[3]。

和陸生動物不同，魚類可以從水體吸收部分礦物元素，但水體礦物元素含量往往不足，因此飼料中必須補充適量的礦物元素來滿足魚類生長的需要[1]。動物缺Co會出現(xiàn)食欲減退、生長受阻、血紅蛋白或紅細(xì)胞成熟因子合成不足等問題[4-5]。目前，有關(guān)Co的需要量、促生長作用、與維生素B12的關(guān)系等研究已在點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)[2]、尖吻鱸(Latescalcarifer)及胡子鯰(Clariasbatrachus)[4]、齊氏羅非魚(Tilapiazillii)[6]、尼羅羅非魚(Oreochromusniloticus)[7]、南亞野鯪(Labeorohita)[8]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[9]上有所報道。生物學(xué)效價常用來評價營養(yǎng)物被吸收、保留和利用的效率[10-11]，不同來源的礦物元素具有不同的生物學(xué)效價。研究發(fā)現(xiàn)，羥基蛋氨酸錳在提高軍曹魚(Rachycentroncanadum)生長、抗氧化和脊椎骨礦物元素沉積方面比硫酸錳和甘氨酸錳效率更高[12]；在提升鮑魚(HaliotisdiscushannaiIno)增重率或堿性磷酸酶活性方面，蛋氨酸鋅的生物學(xué)效價是硫酸鋅的3倍左右[13]；以特定生長率和全魚硒含量為判據(jù)，軍曹魚幼魚對蛋氨酸硒的生物學(xué)效價分別相當(dāng)于亞硒酸鈉的1.2和2.9倍[14]。然而，也有研究報道賴氨酸銅和硫酸銅在影響牛的生長及血清銅藍(lán)蛋白活性及免疫方面沒有顯著差異[15]。目前關(guān)于Co的研究大多涉及氯化鈷(Co-Cl)、碳酸鈷、氧化鈷、乙酸或丙酸鈷鹽等形式[9,16]，尚未見軍曹魚Co需要量及蛋氨酸鈷(Co-Met)和Co-Cl生物學(xué)效價的比較研究。

軍曹魚隸屬鱸形目(Perciformes)，軍曹魚科(Rachycentridae)，軍曹魚屬，亦稱海鱺、海龍、海鯉、竹五等，為暖水性底層魚類，我國主要產(chǎn)于海南、廣東和臺灣等省。軍曹魚是大型肉食性魚類，生長速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，是市場上暢銷的水產(chǎn)品，現(xiàn)已是我國南方沿海海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要對象之一。目前有關(guān)軍曹魚蛋白質(zhì)[17]、脂肪[17]、碳水化合物[18]、維生素[19]及礦物元素需要量[20]以及魚粉替代[21]等營養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)問題已有大量研究。本試驗擬研究飼料中不同Co源和Co含量對軍曹魚幼魚營養(yǎng)生理功能的影響，并比較2種Co源的生物學(xué)效價，旨在為確定軍曹魚幼魚Co需要量并為軍曹魚營養(yǎng)參數(shù)數(shù)據(jù)庫的完善及高效配合飼料的研發(fā)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用Co-Cl為分析純，試驗用Co-Met的Co含量為0.2%，蛋氨酸(Met)含量為1.7%，均購自長沙興嘉生物工程股份有限公司。

1.2 試驗飼料和試驗設(shè)計

以脫維酪蛋白和魚粉為蛋白質(zhì)源，玉米淀粉為糖源，玉米油、魚油和大豆磷脂油為脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料(不添加維生素B12)。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照)、2、4、8、16、32 mg/kg(以Co計)的Co-Cl和Co-Met，共配制出11種試驗飼料(共用對照飼料)。飼料原料粉碎后過60目篩，根據(jù)飼料配方稱取各原料，微量組分采用逐級擴大法混合均勻后，加魚油、玉米油和大豆磷脂油攪拌均勻，再用V型立式混合機混合5 min，然后加30%～40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水，用F-26型雙螺桿擠壓機(華南理工大學(xué)，廣州)制成粒徑為3.0 mm的顆粒飼料，在避光通風(fēng)處風(fēng)干至飼料水分含量為10%左右，封口袋封裝，-20 ℃冰箱冷凍保藏。通過電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS，Agilent 7700x，Agilent Technologies，美國)測定飼料中Co的含量。試驗設(shè)計見表1，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 試驗動物與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在廣東省湛江市南三島海上浮式魚排中進行，試驗所用的軍曹魚幼魚購買于廣東湛江市英利鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶。魚苗暫養(yǎng)2周，期間投喂商品飼料(粗蛋白質(zhì)含量≥55%，粗脂肪含量≥8%)。分組前停食24 h，隨機挑選規(guī)格一致、健康無病的初始體重為(22.18±0.35) g的軍曹魚幼魚，根據(jù)試驗設(shè)計共分為11個組，每組3個重復(fù)，以重復(fù)為單位養(yǎng)殖于2.5 m×1.2 m×1.4 m的網(wǎng)箱，共33個網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱放30尾魚。為減少試驗誤差，所有網(wǎng)箱均隨機擺放。每種飼料投喂3個網(wǎng)箱，每天飽食投喂2次(07:00、18:00)，日投喂量為其體重的6%～9%。養(yǎng)殖期間水體溫度28～33 ℃，pH 7.6～7.8，鹽度29～31，溶氧濃度>6.0 mg/L，試驗期為10周。養(yǎng)殖海水中Co含量為0.12 μg/L。

1.4 樣本采集及測定

試驗結(jié)束后禁食24 h后采樣，以每個網(wǎng)箱為單位稱重計數(shù)。每個網(wǎng)箱隨機取5尾魚(丁香酚麻醉處理)，用2.5 mL的注射器從魚體心臟抽血，放置于1.5 mL的Eppendorf管中，制備抗凝血，待測血液學(xué)指標(biāo)。每個網(wǎng)箱隨機取5尾魚，解剖后迅速取出肝臟放入防凍管，然后放入液氮罐保存，最后轉(zhuǎn)移到-80 ℃中冰箱備用。每個網(wǎng)箱隨機取8尾魚，去除內(nèi)臟后放入沸水中3 min，然后剝離肌肉，取出脊椎骨，以超純水沖洗去掉附著的肌肉。處理后的脊椎骨在105 ℃烘干，然后粉碎過80目篩，以乙醚抽提12 h去除脂肪，并再次105 ℃烘干。

表1 試驗設(shè)計

鈷含量為實測值 Co content was measured value。

表2 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項目 Items含量 Content粗脂肪 Crude lipid11.94粗灰分 Ash4.76水分 Moisture8.92鈷 Co/(mg/kg)0.13

1)脫維酪蛋白購自美國Sigma公司，粗蛋白質(zhì)含量為94%。Vitamin-free casein provided by Sigma Chemical Co., USA, and its crude protein content was 94%.2)去維生素B12預(yù)混料為每千克飼料提供 VB12-free vitamin premix provided the following per kg of the diet：硫胺素 thiamine hydrochloride 25 mg，核黃素 riboflavin 45 mg，泛酸 pantothenic acid 60 mg，煙酸 nicotinic acid 200 mg，鹽酸吡哆醇 pyridoxine hydrochloride 20 mg，生物素 biotin 1.20 mg，肌醇 inositol 800 mg，葉酸 folic acid 20 mg，VA 32 mg，VE 120 mg，VD35 mg，VK310 mg。3)去鈷礦物元素預(yù)混料為每千克飼料提供 Co-free mineral premix provided the following per kg of the diet：CH3CHOHCOO2Ca·5H2O 6 100 mg，Na2HPO46 200 mg，NaF 2 mg，Ca(IO3)20.94 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，MnSO4·H2O 60 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 240 mg，ZnSO4·7H2O 180 mg，MgSO4·7H2O 1 200 mg，NaCl 100 mg，Na2SeO3(1%) 30 mg。4)實測值 Measured values。

飼料營養(yǎng)成分分析[22]：水分含量采用105 ℃常壓干燥法測定；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(KjeltecTM8400，瑞典)測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法(乙醚為抽提劑)測定；粗灰分含量采用550 ℃馬弗爐灼燒法測定。

礦物元素測定：飼料、全魚、肝臟和脊椎骨105 ℃烘干后粉碎過80目篩，然后用硝酸和雙氧水充分消解，用電感耦合等離子體-質(zhì)譜法[22]測定飼料、全魚、脊椎骨和肝臟中Co含量。

血液學(xué)指標(biāo)如紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)均采用法國PENTRA 80全自動血細(xì)胞分析儀測定。

1.5 生長性能計算公式

末均重(FBW，g)=總末重(g)/魚尾數(shù)；增重率(WGR，%)=100×[末均重(g)-初均重(g)]/初均重(g)；特定生長率(SGR，%/ d)=100×[ln末均重(g)-ln初均重(g)]/飼養(yǎng)天數(shù)(d)；飼料系數(shù)(FCR)=攝食飼料干重(g)/[末均重(g)-初均重(g)]；成活率(SR，%)=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SE)表示，采用SPSS 17.0的一般線性模型軟件進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，模型的主效應(yīng)分析包括Co源、Co含量以及兩者之間的互作效應(yīng)。若存在顯著差異，再采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。Co-Met相對于Co-Cl的生物學(xué)效價采用比斜率法[23-24]求得。

2 結(jié) 果

2.1 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚生長性能的影響

由表3可知，2種Co源下SGR、FBW、WGR均隨飼料Co含量的增加呈先上升后下降的趨勢。C-0組的SGR和WGR均顯著低于以Co-Cl為Co源的Co-Cl-4、Co-Cl-8、Co-Cl-16和Co-Cl-32組以及以Co-Met為Co源的Co-Met-4、Co-Met-8、Co-Met-16和Co-Met-32組(P<0.05)。Co-Cl-32和Co-Met-32組SGR和WGR均顯著低于Co-Cl-16和Co-Met-16組(P<0.05)。Co-Cl組中，WGR及FBW在Co-Cl-16組最大；Co-Met組中，WGR及FBW在Co-Met-8組最大。Co-Cl組中，SR在Co-Cl-32組最低，顯著低于除Co-Cl-4組外的其他各組(P<0.05)，且FCR顯著高于Co-Cl-2、Co-Cl-8和Co-Cl-16組(P<0.05)；Co-Met組中，Co-Met-8組SR相比Co-0組顯著降低(P<0.05)，但其他組與Co-0組無顯著差異(P>0.05)，Co-Met-2組FCR顯著高于Co-Met-16組(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，飼料Co含量對FBW、SGR、WGR和FCR有極顯著影響(P<0.01)，對SR無顯著影響(P>0.05)；飼料Co源對FBW、SGR、WGR、FCR和SR均無顯著影響(P>0.05)；飼料Co源與Co含量的交互作用對SGR、WGR和SR有顯著影響(P<0.05)，對FBW和FCR無顯著影響(P>0.05)。以SGR為依據(jù)時，通過二次回歸曲線分析得出飼料中添加Co-Cl和Co-Met形式的Co分別至19.40和17.75 mg/kg時，軍曹魚幼魚可以獲得最大SGR(圖1)。由圖2可知，以SGR為判據(jù)，軍曹魚幼魚對Co-Met的生物學(xué)效價(以Co-Cl為基準(zhǔn))相當(dāng)于Co-Cl的1.47倍(線性模擬結(jié)果，以Co-Cl為Co源：y=0.018 8x+2.527 6，R2=0.996 8；以Co-Met為Co源：y=0.027 7x+2.510 8，R2=0.975 2；Co-Met相對于Co-Cl的生物學(xué)效價=0.027 7/0.018 8=1.47)。

2.2 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表4可知，Co-Cl組中，Co-Cl-8、Co-Cl-16和Co-C-32組RBC顯著高于C-0組(P<0.05)；C-0組HGB最低且顯著低于其他各組(P<0.05)；C-0和Co-Cl-2組HCT顯著低于其他各組(P<0.05)。Co-Met組中，C-0組RBC、HGB、HCT顯著低于其他各組(P<0.05)；Co-Met-32組HGB顯著低于Co-Met-16組(P<0.05)。2種Co源下RBC、HGB、HCT均隨飼料Co含量的增加呈先上升后下降的趨勢。雙因素方差分析顯示，飼料Co含量對RBC、HGB和HCT均有極著影響(P<0.01)；飼料Co源對RBC有極著影響(P<0.01)，對HGB和HCT無顯著影響(P>0.05)；飼料Co源和Co含量的交互作用對HCT有極著影響(P<0.01)，對RBC和HGB無顯著影響(P>0.05)。以RBC為判據(jù)時，軍曹魚幼魚對Co-Met的生物學(xué)效價(以Co-Cl為基準(zhǔn))相當(dāng)于Co-Cl的1.49倍(線性模擬結(jié)果，以Co-Cl為Co源：y=0.054 3x-0.432 8，R2=0.947 3；以Co-Met為Co源：y=0.080 7x-2.913 8，R2=0.778 0；Co-Met相對于Co-Cl的生物學(xué)效價=0.080 7/0.054 3=1.49)。

表3 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚生長性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示顯著差異(P<0.05)。下表同。Values in the same column with different letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

圖1 軍曹魚幼魚對2種Co源中Co的需要量

圖2 Co-Met的相對生物學(xué)效價

表4 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.3 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚組織Co含量的影響

由表5可知，2種Co源下，脊椎骨和全魚Co含量隨著飼料Co含量的增加而升高。雙因素方差分析顯示，飼料Co含量對脊椎骨和全魚Co含量有極顯著影響(P<0.01)，對肝臟Co含量無顯著影響(P>0.05)；飼料Co源對脊椎骨Co含量有極顯著影響(P<0.01)，對全魚和肝臟Co含量無顯著影響(P>0.05)；飼料Co源和Co含量的交互作用對脊椎骨和全魚Co含量有顯著影響(P<0.05)，對肝臟Co含量無顯著影響(P>0.05)。以脊椎骨Co沉積量為判據(jù)時，軍曹魚幼魚對Co-Met的生物學(xué)效價(以Co-Cl為基準(zhǔn))相當(dāng)于Co-Cl的1.12倍(線性模擬結(jié)果，以Co-Cl為Co源：y=0.051 1x+0.072 1，R2=0.965 9；以Co-Met為Co源：y=0.057 1x+0.099 0，R2=0.993 7；Co-Met相對于Co-Cl的生物學(xué)效價=0.057 1/0.051 1=1.12)。

表5 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚組織Co含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

3 討 論

3.1 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚生長性能的影響

本試驗條件下(去維生素B12)，軍曹魚幼魚的SGR及WGR均隨著飼料Co含量的增加呈先上升后下降趨勢，以SGR為判據(jù)，的Co分別至軍曹魚幼魚對Co-Cl和Co-Met形式的Co的需要量分別為19.40和17.75 mg/kg。魚類對Co的需要量可能受魚的種類(海水魚、淡水魚)、基礎(chǔ)飼料中維生素B12含量、養(yǎng)殖水體Co含量、Co源種類、魚的規(guī)格、基礎(chǔ)飼料組成、評定指標(biāo)的影響。研究報道，以WGR為判據(jù)，點帶石斑魚對Co的需要量為10 mg/kg[2]；在飼料中缺少維生素B12的情況下，草魚幼魚獲得最佳生長時對飼料中Co的需要量大約為0.88 mg/kg[25]，在未去維生素B12的情況下，對Co的需要量為0.20 mg/kg。飼料中Co-Met的添加量為15 mg/kg時凡納濱對蝦(Penaeusvanmamei)生長最快[26]；尼羅羅非幼魚對飼料中Co的需要量為0.3～3.0 mg/kg[27]；牙鲆幼魚(Paralichthysolivaceus)在基礎(chǔ)飼料Co含量為1.43 mg/kg時Co的適宜添加量為0.8 mg/kg。Co促進動物生長的主要原因可能為：1)Co促進動物腸道微生物群合成動物生長所需的維生素B12，維生素B12是造血性維生素，是動物生長所必需的[2,28]；2)Co通過輔酶形式參與機體造血和營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、糖類、脂肪)的代謝過程，促進氮的吸收，促進生長[5]；3)適宜含量的Co改善了魚類腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)，保護了魚類器官組織[7]；4)Co通過影響相關(guān)基因的表達，提升動物的抗氧化能力和增強抗炎反應(yīng)[3,29]。然而，高劑量(32 mg/kg)添加組軍曹魚幼魚的生長性能出現(xiàn)下降，SR顯著降低，這表明軍曹魚幼魚對該劑量的Co不耐受，這與草魚試驗中0.95和1.63 mg/kg Co組在試驗后期生長變緩的結(jié)果一致[25]。分析其原因，飼料Co含量過高可能產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致腸道出血或損傷和白血球的異常變化[30]。另外，鐵、錳和Co共用部分轉(zhuǎn)運通道，過量增加Co會抑制鐵和錳的吸收利用[31-32]。以Co-Met為Co源，SR在Co-Met-8組顯著下降，其他Co-Met組與C-0組均無顯著差異，WGR和SGR也在該組顯著提升，說明SR顯著降低不是Co含量導(dǎo)致。實際養(yǎng)殖過程中，影響SR的因素很多，包括飼料質(zhì)量、具體養(yǎng)殖環(huán)境、偶然的病害因素、某種未知的偶然因素等，其原因有待探究。

3.2 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚血液學(xué)指標(biāo)的影響

Co增強機體造血機能的渠道有：1)Co抑制細(xì)胞多種重要酶(如細(xì)胞色素氧化酶)活性或通過其他方式使機體紅細(xì)胞生成素(Epo)增多刺激造血；2)適宜含量的Co可以促進鐵的吸收，使鐵較易進入骨髓利用；3)Co通過維生素B12參與核糖核酸及造血有關(guān)物質(zhì)的代謝，作用于造血過程[33]。研究顯示，尼羅羅非魚的紅細(xì)胞比容、HGB、RBC均受Co的影響而顯著提升[27]；飼料中添加Co可以提高草魚幼魚的HGB、血小板計數(shù)(PLT)、HCT和RBC[25]。Co可以穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，激活促紅細(xì)胞生成素基因，增強血紅蛋白紅血球的合成[34]。本試驗中，2種Co源下添加不同水平Co后，軍曹魚幼魚的RBC、HGB、HCT均有不同程度是上升，與前人研究結(jié)果一致。C-0組軍曹魚幼魚的各血液學(xué)指標(biāo)均低于各Co添加組，說明海水及基礎(chǔ)飼料中的Co并不能滿足軍曹魚幼魚正常生理需要。2種Co源下，添加32 mg/kg Co組的RBC、HGB、HCT均比添加16 mg/kg Co組有所下降，說明Co含量過高反而會對造血能力有不利影響。

3.3 飼料Co源和Co含量對軍曹魚幼魚組織Co沉積的影響

3.4 不同Co源生物學(xué)效價比較

不同礦物元素在機體內(nèi)的吸收利用通常存在一定的拮抗作用，如鐵和銅之間，鋅和鐵、錳、銅之間，Co和錳之間等[30,36]。加之，飼料原料中存在的植酸、纖維素和磷酸根等，干擾微量元素的吸收，如白魚粉中大量的羥磷灰石會降低魚類對鋅的利用[37]。生物學(xué)效價常用來比較不同營養(yǎng)物被機體吸收利用的效率[10]。有機螯合物相比無機化合物通常具有較高的生物學(xué)效價[12-14]。研究顯示，羥基蛋氨酸錳的生物學(xué)效價是硫酸錳的1.09～2.47倍[12]，蛋氨酸鋅的生物學(xué)效價是硫酸鋅的3倍左右[13]，蛋氨酸硒的生物學(xué)效價是亞硒酸鈉的1.20～2.90倍[14]。本試驗以SGR、RBC、脊椎骨Co含量為判據(jù)，Co-Met的生物學(xué)效價分別相當(dāng)于Co-Cl的1.47、1.49、1.12倍。分析其原因，Co-Met是一種新型氨基酸螯合劑，Met與Co的螯合比為2∶1，為無價態(tài)的絡(luò)合物，可以順利通過富含陰離子的細(xì)胞膜；微量元素的氨基酸螯合物可能是以氨基酸形式吸收，避免了微量元素之間的拮抗作用，不僅可以提高Co的利用，還有利其他元素的吸收[29]；同時，Co-Met也可以提供Met，而Met是魚類的第一限制性氨基酸。因此，Co-Met具有雙重營養(yǎng)功能，能夠較好為軍曹魚幼魚機體利用。

4 結(jié) 論

① 飼料中以Co-Cl或Co-Met形式添加適宜水平的Co均有助于提升軍曹魚幼魚的生長性能、機體造血能力，且Co-Met在促進生長、造血或組織Co沉積方面效率更高。

② 以SGR為判據(jù)時，以Co-Cl和Co-Met為Co源，軍曹魚幼魚對Co的需要量分別為19.40、17.75 mg/kg。

③ 軍曹魚幼魚對Co-Met的生物學(xué)效價為Co-Cl的1.12～1.49倍。