寇 嬌 梁海威 劉 寧 戴兆來 李 菊 潘俊良 朱芳周 伍國(guó)耀,4 武振龍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.河南銀發(fā)牧業(yè)有限公司，鄭州 451100；3.鄭州新威營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司，鄭州 450100；4.德克薩斯州農(nóng)工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，大學(xué)城 77843)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)最主要的糧食作物之一，其蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)等含量豐富。除食用外，小麥還是重要的能量飼料原料。隨著國(guó)內(nèi)玉米價(jià)格的上漲，小麥及其副產(chǎn)品由于具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與玉米相近、價(jià)格相對(duì)平穩(wěn)等優(yōu)勢(shì)在飼料工業(yè)中的應(yīng)用逐漸增多。小麥蛋白(也稱谷朊粉、活性面筋粉)是小麥淀粉生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，由麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥清蛋白和麥球蛋白組成，前2種蛋白質(zhì)組分約占小麥蛋白的90%[1]。小麥蛋白特殊的結(jié)構(gòu)造成其水溶性低、黏性大，因而限制了其在飼料中的添加和應(yīng)用[2-3]。近年來，隨著生物酶解技術(shù)發(fā)展，以小麥蛋白為原料經(jīng)復(fù)合酶解加工工藝制備而來的水解產(chǎn)物[也稱小麥水解蛋白(hydrolyzed wheat gluten,HWG)、小麥水解活性肽等]提高了其可溶性與消化率，并且含有多種活性小肽，推動(dòng)了其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用。

HWG的蛋白質(zhì)含量約為80%，富含多種氨基酸和小肽，如谷氨酰胺、谷氨酸和亮氨酸，其中谷氨酰胺約占氨基酸總量的30%[4-5]。谷氨酰胺和谷氨酸是豬腸道發(fā)育的重要能量底物和信號(hào)分子。飼糧中67%左右的谷氨酰胺和97%左右的谷氨酸在小腸被分解利用，維持小腸上皮細(xì)胞的增殖與更新，保障腸黏膜的屏障功能和腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)[6]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1%谷氨酰胺能夠提高血漿中谷氨酰胺含量，改善斷奶仔豬小腸絨毛結(jié)構(gòu)，提高上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)，減少腸上皮細(xì)胞通透性[6-7]。谷氨酰胺調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)主要是通過鈣調(diào)素依賴蛋白酶[8]。同時(shí)谷氨酰胺、谷氨酸能夠緩解氧化應(yīng)激引起的豬腸上皮細(xì)胞凋亡，維持腸上皮屏障功能[9]。亮氨酸是機(jī)體重要的必需氨基酸，約占機(jī)體氨基酸的7%。飼糧中補(bǔ)充亮氨酸能夠促進(jìn)仔豬腸絨毛發(fā)育，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，提高仔豬的生長(zhǎng)性能[10]。

HWG作為一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白質(zhì)，在歐洲等國(guó)家廣泛應(yīng)用于乳仔豬教槽料、水產(chǎn)料、犢牛代奶粉及寵物飼料[11]。斷奶仔豬飼糧中添加HWG可顯著提高斷奶仔豬平均日增重，降低料重比和腹瀉率，提高空腸絨毛長(zhǎng)度并顯著降低隱窩深度，從而緩解斷奶應(yīng)激造成的腸黏膜損傷和生長(zhǎng)受阻等影響[12]。HWG可部分替代魚粉，從而降低飼料成本[13]。妊娠后期胎兒及乳腺快速發(fā)育、母豬體內(nèi)激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝急劇變化，其營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)胎豬生長(zhǎng)性能和繁殖性能有重要影響。到目前為止，HWG在母豬飼糧中的研究還鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過在母豬妊娠后期飼糧中添加HWG，研究其對(duì)母豬繁殖性能、血清生化指標(biāo)和氨基酸含量及胎盤組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響，為其在母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的HWG由鄭州新威營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司提供，其氨基酸組成見表1。

表1 HWG的氨基酸組成

1)實(shí)測(cè)值。Measured values.2)蛋白質(zhì)水解后天冬酰胺以天冬氨酸的形式被檢測(cè)。The asparagine was determined as aspartate in protein hydrolysate.3)蛋白質(zhì)水解后谷氨酰胺以谷氨酸的形式被檢測(cè)。The glutamine was determined as glutamate in protein hydrolysate.

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物、分組與飼養(yǎng)管理

選用3～4胎次、預(yù)產(chǎn)期相近的妊娠第90天的大白母豬33頭，其隨機(jī)分為3組，每組11個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭母豬。參考NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配制妊娠母豬基礎(chǔ)飼糧，對(duì)照組母豬飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組母豬在基礎(chǔ)飼糧中于妊娠第90～114天期間分別添加1%和2%的HWG，所有飼糧均以丙氨酸和玉米淀粉進(jìn)行等能等氮，并平衡必需氨基酸。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。試驗(yàn)期間每日飼喂2次(06:00和14:00)，飼喂量為kg/d，預(yù)產(chǎn)期前1周將試驗(yàn)?zāi)肛i轉(zhuǎn)入徹底消毒的產(chǎn)房，其余按豬場(chǎng)日常管理程序進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

表2 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 8 550 IU，VB10.11 mg，VB23.2 mg，VB120.017 mg，VD11 544 IU，VE 34.6 IU，生物素 biotin 0.172 mg，葉酸 folic acid 1.58 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 18 mg，煙酸 nicotinic acid 25 mg，Cu (as copper sulfate) 13.2 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 120 mg，Mn (as manganese sulfate) 70 mg，Zn (as zinc sulfate) 68 mg，I (as potassium iodide) 1.84 mg，Se (as sodium selenite) 0.4 mg。2)消化能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。DE was a calculated value, while the others were measured values.3)粗蛋白質(zhì)包括飼糧中添加的丙氨酸和HWG。CP included the alanine and HWG added to the diet.4)飼料水解后谷氨酰胺以谷氨酸的形式被檢測(cè)。Glu was determined as glutamate in feed hydrolysate.

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 母豬繁殖性能測(cè)定

在母豬分娩結(jié)束4 h內(nèi)，記錄每頭母豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、死胎數(shù)、仔豬初生窩重和初生活仔窩重，并計(jì)算仔豬平均初生重和平均初生活仔重。

1.3.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

于母豬妊娠第107天，每組隨機(jī)選取6頭母豬，采集前腔靜脈血；母豬分娩時(shí)，每組隨機(jī)選取6頭母豬，采集臍帶血。血樣室溫靜置1 h后，3 000×g離心10 min，取上清液于-20 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)分析。

1.3.3 血清游離氨基酸含量的測(cè)定

高效液相色譜(HPLC)測(cè)定血清中的游離氨基酸含量，樣品前處理：將血清樣品從-20 ℃取出，冰上溶化，取20 μL血清樣品于1.5 mL離心管；加入80 μL 1.5 mol/L HClO4除去血清中蛋白質(zhì)，振蕩混勻，4 ℃靜置30 min；加入40 μL 2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH，振蕩混勻；14 800 r/min離心10 min，取50 μL上清液于1.5 mL離心管，用HPLC水稀釋3倍；取50 μL稀釋后樣品、50 μL 1.2%苯甲酸和700 μL HPLC水于HPLC自動(dòng)進(jìn)樣瓶中混勻，于HPLC儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))測(cè)定。

1.3.4 胎盤組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定

母豬自然分娩排出胎盤時(shí)，采集胎盤絨毛膜樣品于-20 ℃保存。胎盤組織樣品采用TRIpure試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，北京)提取mRNA，通過核酸蛋白測(cè)定儀(IMPLEN，德國(guó))測(cè)定各樣品總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(天根生化科技有限公司，北京)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(7500 Real-Time PCR，Applied Biosystems，美國(guó))檢測(cè)目的基因的表達(dá)，基因引物序列見表3。反應(yīng)體系為10 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，2×SuperReal Premix 5 μL，Rox染料0.2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)程序如下：1)95 ℃預(yù)變性15 min；2)PCR反應(yīng)：95 ℃變性10 s，60 ℃退火32 s，循環(huán)40次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算[14]。

表3 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3軟件中one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，GraphPad Prism 6.0軟件作圖。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬繁殖性能的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1%HWG顯著提高了仔豬平均初生活仔重(P<0.05)；飼糧中添加2%HWG顯著提高了仔豬初生

窩重和初生活仔窩重(P<0.05)。飼糧中添加HWG對(duì)窩產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、死胎數(shù)、平均初生重?zé)o顯著影響(P>0.05)。

2.2 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬和臍帶血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1%HWG顯著降低了妊娠第107天母豬和臍帶血清中血氨含量(P<0.05)；飼糧中添加2%HWG顯著提高了臍帶血清中白蛋白、葡萄糖含量和堿性磷酸酶活性(P<0.05)，顯著降低了母豬和臍帶血清中血氨含量(P<0.05)。

表4 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬繁殖性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。In the same row, values with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表5 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬和臍帶血清生化指標(biāo)的影響

2.3 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬和臍帶血清中氨基酸含量的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1%HWG顯著提高了妊娠第107天母豬血清中天冬酰胺、組氨酸、纈氨酸和鳥氨酸含量(P<0.05)，顯著降低了母豬血清中甘氨酸含量(P<0.05)；飼糧中添加2%HWG顯著提高了母豬血清中天冬酰胺、組氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和鳥氨酸含量(P<0.05)，顯著降低了母豬血清中甘氨酸含量(P<0.05)。

表6 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)母豬血清中氨基酸含量的影響

如表7所示，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1%HWG顯著提高了臍帶血清中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量(P<0.05)；飼糧中添加2%HWG顯著提高了臍帶血清中精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸含量(P<0.05)。

2.4 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)胎盤組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加1%HWG顯著提高了胎盤組織中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(SNAT2)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體3(EAAT3)、L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(LAT2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(GLUT2)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；飼糧中添加2% HWG顯著提高了胎盤組織中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(SNAT1)、SNAT2、EAAT3、LAT2，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PepT1)、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(PepT2)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(GLUT1)、GLUT2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體3(GLUT3)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表7 妊娠后期飼糧中添加HWG對(duì)臍帶血清中氨基酸的影響

3 討 論

妊娠期間胎兒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要決定于母體的營(yíng)養(yǎng)狀況和胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效率[15]。在實(shí)際養(yǎng)豬生產(chǎn)中常通過限飼的方法減少母豬在妊娠期體脂過度積累，同時(shí)也在一定程度上限制了胎兒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和生長(zhǎng)發(fā)育。胎兒60%的體增重均發(fā)生在妊娠后期，尤其是妊娠第90～114天，限飼對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育帶來的影響在這一階段可能更為明顯[16]。蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)在調(diào)節(jié)胎兒生長(zhǎng)、發(fā)育和存活中起著重要作用[17]。蛋白質(zhì)缺乏或不平衡可能引起胎兒體增重減慢，均勻度降低，增加宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)仔豬的發(fā)生率[18]。HWG是一種天然的植物源性蛋白質(zhì)，富含谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和小肽。HWG對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響目前還未見報(bào)道。本試驗(yàn)在妊娠后期母豬飼糧中添加HWG，探討其對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2%HWG顯著提高了仔豬初生窩重和初生活仔窩重，這與前人研究在母豬飼糧中添加谷氨酰胺提高初生活仔窩重和平均初生重，降低窩內(nèi)變異系數(shù)的結(jié)果[6,19]相一致。本試驗(yàn)檢測(cè)了母豬和臍帶血清中游離氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧中添加1%和2%HWG顯著提高了母豬血清中天冬氨酸、組氨酸和鳥氨酸含量，顯著降低了甘氨酸含量；飼糧中添加1%HWG顯著提高了臍帶血清中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量；飼糧中添加2%HWG顯著提高了臍帶血清中精氨酸、谷氨酸、谷氨酸氨、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸含量。這提示HWG添加可能通過促進(jìn)氨基酸更多轉(zhuǎn)運(yùn)到臍帶血，促進(jìn)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。血清生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加HWG對(duì)母豬血清中總蛋白、白蛋白、葡萄糖、尿素氮含量和堿性磷酸酶活性無顯著影響，但顯著降低了血氨含量；飼糧中添加2%HWG顯著提高了臍帶血清中白蛋白、葡萄糖含量和堿性磷酸酶活性，減少了血氨的生成，提示HWG提高了仔豬的營(yíng)養(yǎng)供給和蛋白質(zhì)的利用效率。這可能是HWG提高了仔豬平均初生重的原因之一[5]。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

胎盤是母體血液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒的主要器官，胎盤組織中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體是調(diào)節(jié)胎兒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給的重要介質(zhì)[20-21]。HWG可提高臍帶血清中氨基酸和葡萄糖的含量[16]，本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了妊娠后期胎盤組織中重要的氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2%HWG顯著提高了母豬胎盤組織的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SNAT1、SNAT2、EAAT3、LAT2和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1、PepT2以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT1、GLUT2、GLUT3的mRNA表達(dá)量。葡萄糖是胎兒和胎盤的主要能量底物，氨基酸可以通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。這提示HWG可能通過調(diào)節(jié)胎盤組織中氨基酸和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，改善母體到胎兒的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸。

以上結(jié)果表明，妊娠后期母豬飼糧中添加HWG可以提高母豬血清中氨基酸含量，調(diào)節(jié)胎盤組織中氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，從而改善胎兒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和蛋白質(zhì)利用效率，促進(jìn)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而提高仔豬初生窩重、初生活仔窩重。我國(guó)小麥蛋白資源豐富，通過酶解工藝的優(yōu)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水解蛋白，有助于實(shí)現(xiàn)已有蛋白質(zhì)資源高效利用，減少我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)對(duì)進(jìn)口大豆的依存度，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié) 論

母豬妊娠后期飼糧中添加HWG可提高胎盤組織中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的表達(dá)，促進(jìn)母體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和胎豬的生長(zhǎng)發(fā)育，提高仔豬初生窩重和初生活仔窩重。