聶 煉 張愛忠 姜 寧 楊卓妮娜

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是重要的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，可以識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，進而引發(fā)下游通路，調(diào)控細(xì)胞因子、炎癥因子等的轉(zhuǎn)錄表達[1]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)廣泛存在動物體所有細(xì)胞中，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[2]。未活化狀態(tài)下NF-κB與NF-κB的抑制蛋白(inhibitor kappa B,IκB)結(jié)合處于休眠狀態(tài)，當(dāng)受到上游信號的刺激時會快速響應(yīng)，進而啟動免疫應(yīng)答。大多數(shù)研究結(jié)果表明，在患有炎癥疾病的人類和動物體內(nèi)，NF-κB處于過度活化狀態(tài)，使炎癥反應(yīng)加重危害健康。益生菌以其強大的益生作用廣泛的應(yīng)用于人和動物中，不僅可以增強機體免疫力、促進胃腸道消化和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，近年的研究結(jié)果表明益生菌還可以預(yù)防治療潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等炎癥疾病[3]。益生菌治療炎癥疾病涉及到的信號通路主要是TLR-NF-κB信號通路，通過下調(diào)TLR，抑制IκB的降解使NF-κB處于休眠狀態(tài)達到減緩炎癥反應(yīng)的效果。因此，深入了解TLR-NF-κB信號通路的發(fā)生機理以及益生菌對其的調(diào)控機制對臨床疾病的防治有著非常重要的指導(dǎo)意義。

1 TLR

1.1 結(jié)構(gòu)與分類

TLR是一種可以特異性識別病原微生物的細(xì)胞表面模式識別受體，它的結(jié)構(gòu)決定了其獨特的功能。TLR屬于橫跨細(xì)胞膜的Ⅰ型跨膜蛋白，主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。其中胞內(nèi)區(qū)是TLR的核心區(qū)域，它可以引起下游信號級聯(lián)反應(yīng)，激發(fā)其他信號通路的產(chǎn)生[4]。

TLR種類眾多，其中人體中發(fā)現(xiàn)11種TLR(TLR1～TLR11)，在鼠中發(fā)現(xiàn)13種TLR(TLR1～TLR13)。有報道稱在雞中也發(fā)現(xiàn)10種TLR，其中chTLR1LA、chTLR1LB和chTLR15是雞特有的[5]。目前研究較為深入的有TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。TLR在免疫系統(tǒng)中具有非常重要的作用，在樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和上皮細(xì)胞均有表達。

1.2 TLR的配體

TLR可以特異性地識別病原微生物，通過其獨特的跨膜結(jié)構(gòu)，將信號傳遞到細(xì)胞中，引起其他級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB等誘導(dǎo)因子的轉(zhuǎn)化，從而啟動固有免疫和獲得性免疫。TLR可以識別很多配體，其中TLR1可以識別細(xì)菌、真菌細(xì)胞細(xì)胞壁部分；TLR2、TLR6可以識別損傷組織的雙鏈RNA、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸等；TLR3識別病毒雙鏈RNA；TLR4可以識別脂多糖、防御素、纖維蛋白等；TLR5可以識別細(xì)菌鞭毛蛋白；TLR7可以識別單鏈RNA；TLR9可以識別DNA中非甲基化胞苷-磷酸鹽-鳥苷(CpG)[6]。TLR可以識別的配體如圖1所示。

圖1 外來抗原微生物的不同細(xì)胞表面配體與TLR家族關(guān)系示意圖

2 NF-κB

2.1 生物學(xué)特性

NF-κB是一種幾乎存在于所有細(xì)胞中的反轉(zhuǎn)錄因子，一般情況下與NF-κB的抑制蛋白IκB結(jié)合處于休眠狀態(tài)。在癌癥和免疫學(xué)中，NF-κB扮演非常重要的角色，尤其是對免疫調(diào)節(jié)的作用。NF-κB家族有5個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，分別是p50、p52、p65、RelB和c-Rel，這些轉(zhuǎn)錄因子可以相互組合形成同源或者異源二聚體。NF-κB家族共同具有1個N-末端DNA結(jié)合域，也稱Rel同源域(Rel homology domain,RHD)，RHD可與多個靶基因結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[7]。NF-κB可以調(diào)節(jié)包括白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α等400多種基因的表達，所以NF-κB經(jīng)常被稱為控制基因表達的開關(guān)。

2.2 在免疫系統(tǒng)中的作用

在免疫系統(tǒng)中，NF-κB可以影響免疫器官的形成，其中黏附分子、細(xì)胞因子、器官趨化因子都會受到NF-κB的調(diào)控。在敲除RelB的小鼠中，脾臟的發(fā)育受到影響產(chǎn)生缺陷，而在敲除RelB、p52的小鼠中，白髓區(qū)與紅髓區(qū)之間的巨噬細(xì)胞也處于混亂狀態(tài)[8]。NF-κB還可以參與造血細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。有報道稱，在缺失p50和p65的小鼠中出現(xiàn)了粒細(xì)胞增多癥而影響細(xì)胞增殖；NF-κB在獲得性免疫中扮演重要角色，在敲除p65的試驗中，小鼠的B細(xì)胞、T細(xì)胞增殖、活化被抑制；此外，NF-κB會影響CD86和CD80的激活，CD8+T細(xì)胞的激活也會涉及到NF-κB的參與[9]。

2.3 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

當(dāng)機體正常生理功能受到威脅時會產(chǎn)生一種自我保護的方式，即炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)會對機體健康產(chǎn)生非常不利的影響，例如潰瘍性結(jié)腸炎、癌癥等，而大量研究表明，這些炎癥反應(yīng)均與NF-κB有關(guān)。NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要分為3個階段，分別為潛伏階段、誘導(dǎo)階段和消退階段。1)潛伏階段：在受到NF-κB活化之前，與炎癥刺激相關(guān)的細(xì)胞因子、與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因和一些病毒基因表達量非常低，稱為“基礎(chǔ)水平”，這些處于潛伏階段的基因在受到NF-κB誘導(dǎo)之后會迅速表達。在潛伏階段，NF-κB家族中的Rel基因都會進行表達，p50會和p65形成異二聚體，并且與NF-κB的抑制物IκB相結(jié)合[10]。除此之外，p50自身形成二聚體p50—p50會游離在細(xì)胞中與其他調(diào)節(jié)因子作用保持下游基因的沉默，RelB和c-Rel也會有表達。但是由于這些家族基因都需要NF-κB的誘導(dǎo)，所以在潛伏期中表達量非常低[11]。2)誘導(dǎo)階段：誘導(dǎo)NF-κB活化的誘導(dǎo)物主要有促炎因子、TNF和一些抗原，這些誘導(dǎo)物會與細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的識別受體相結(jié)合，引起級聯(lián)反應(yīng)，進而活化IκB激酶(IKK)復(fù)合物。IKKα、IKKβ和IKKγ是這類復(fù)合物的主要存在形式，其中IKKβ將IκB磷酸化，IκB進一步被蛋白酶降解。一般情況下IκB與p65—p50異二聚體相結(jié)合，在IκB被降解后，p65—p50異二聚體進入細(xì)胞核與下游基因上的特定位點結(jié)合并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達[12]。3)消退階段：隨著炎癥反應(yīng)的持續(xù)，促炎因子的濃度降低，IκB的降解也變得緩慢，NF-κB的表達會持續(xù)減少，進而降低炎癥反應(yīng)[13]。

3 益生菌對TLR-NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)

3.1 TLR-NF-κB信號傳導(dǎo)通路

TLR作為一種PRRs可以識別不同的外來微生物，進而啟動非常復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些信號網(wǎng)絡(luò)涉及到的接頭蛋白和蛋白酶激酶主要包括p38絲裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、活化蛋白以及NF-κB[14]。由于對TLR2以及TLR4的研究深入，TLR-NF-κB信號通路也得到了較為充分的認(rèn)識。目前大量研究證實NF-κB是TLR信號傳遞的主要通路，大量基因的表達都會受到TLR誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活。在細(xì)胞中，NF-κB的RHD一般與其抑制因子IκB結(jié)合而處于休眠狀態(tài)，當(dāng)PAMPs刺激TLR的TIR區(qū)域，TLR產(chǎn)生反應(yīng)并將信號傳遞到NF-κB通路，NF-κb與IκB迅速分開，NF-κB進入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)與相關(guān)DNA序列結(jié)合，進而對下游細(xì)胞因子或靶基因進行調(diào)節(jié)。有趣的是，不同的TLR激活TLR-NF-κB信號通路的途徑不同，目前普遍認(rèn)為的2條途徑分別是髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴途徑和MyD88非依賴途徑[15]。TLR-NF-κB信號通路如圖2所示。

MyD88依賴途徑：在細(xì)胞間，脂多糖、IL-1和TNF等炎癥因子與TLR4相結(jié)合，TLR4將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，TLR4的TIR區(qū)與MyD88的羧基端結(jié)合，并且MyD88的氨基端與IL-1受體相關(guān)激酶的氨基端結(jié)合，進而激活白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶(IRAK)自身的磷酸化，獲得的IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK6激活下游通路。其中IRAK1、IRAK2和IRAK4激活TNF受體，IRAK6激活I(lǐng)KK，IKK復(fù)合物使IκB磷酸化，IκB被泛素連接酶泛素化而降解，進而使原本與IκB相結(jié)合的NF-κB從休眠狀態(tài)激活，NF-κB進入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。

MyD88非依賴途徑：是指在信號傳遞過程中不經(jīng)過MyD88作用，而通過信號傳導(dǎo)中間體TLR銜接分子(Toll-like receptor adapter molecule,TICAM)1和TICAM2激活干擾素調(diào)控因子，干擾素調(diào)控因子經(jīng)活化后進入細(xì)胞核內(nèi)啟動Ⅰ型干擾素基因的表達。Toll作用蛋白(Toll-interacting protein,TOLLIP)可以抑制TLR信號傳遞，阻止蛋白激酶的磷酸化，進而阻斷MyD88依賴性信號傳遞途徑[16]。Fu等[17]用脂多糖刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，最后結(jié)果表明TLR4、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子mRNA水平顯著上調(diào)，除此之外，TOLLIPmRNA水平也顯著上調(diào)，說明脂多糖既激活了TLR4引導(dǎo)的MyD88依賴性途徑,也激活了MyD88非依賴性途徑。Hou等[18]研究表明脂多糖可以刺激敲除MyD88的細(xì)胞編碼干擾素誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達，直接通過干擾素調(diào)節(jié)因子3與NF-κB相結(jié)合來產(chǎn)生作用而不通過MyD88依賴途徑。

3.2 益生菌對TLR-NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)機制

益生菌作為飼料添加劑在畜牧業(yè)中有非常廣泛的應(yīng)用。在動物飼糧中添加益生菌可以實現(xiàn)有益菌在胃腸道中的定植、促進腸道黏膜和腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育、維護腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整性、提高腸道菌群豐度,并且可通過多種方式維持腸道免疫平衡，對動物的健康生長、生產(chǎn)有非常積極的作用。除此之外，有大量研究表明益生菌可以通過抑制TLR-NF-κB信號通路的激活來改善腸道黏膜炎癥，達到控制疾病的目的。

LPS：脂多糖 lipopolysaccharides；IL-1：白細(xì)胞介素-1 interleukin-1；TNF：腫瘤壞死因子 tumor necrosis factor：TLR：Toll樣受體 Toll-like receptor；MyD88：髓樣分化因子88 myeloid differentiation primary response protein 88；IRAK：白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶 interleukin receptor-associated kinase；IKK：核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制物激酶 inhibitor of nuclear factor-κB kinase；IκB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白 inhibitor of nuclear factor-κB；NF-κB：核轉(zhuǎn)錄因子-κB nuclear factor-κB；TRIF：β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白 TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β；TBK1：箱式結(jié)合激酶1 tank-binding kinase 1；IRF3：干擾素調(diào)節(jié)因子-3 interferon regulatory factor-3;Cytoplasm：細(xì)胞質(zhì)；IKK complex：IKK復(fù)合體；Degradation：降解；Nucleus：細(xì)胞核。

在無刺激條件下，細(xì)胞質(zhì)中NF-κB與IκB結(jié)合在一起而處于休眠狀態(tài)，當(dāng)炎性因子刺激TLR，進而通過MyD88依賴途徑激活NF-κB信號途徑，IκB會被激酶磷酸化，經(jīng)過泛素化而降解。當(dāng)NF-κB與IκB分開后，會迅速進入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)特定DNA特殊位點相結(jié)合，來啟動與炎性反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，危害動物體健康。研究發(fā)現(xiàn)，一些益生菌活菌體、死菌體及其胞外代謝物對動物體炎癥反應(yīng)有一定的改善作用[19]。當(dāng)攝入益生菌時，益生菌可以對TLR-NF-κB信號通路進行干預(yù)，抑制TLR的表達，調(diào)控IκB的磷酸化和泛素化，抑制IκB的降解，阻止NF-κB進入細(xì)胞核，進而阻止NF-κB對下游因子的調(diào)控。益生菌也可以通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)依賴的信號通路將NF-κB亞基p65從細(xì)胞核中輸導(dǎo)出來從而限制NF-κB通路，有效阻止腸炎的產(chǎn)生，改善胃腸道免疫環(huán)境[20]。目前關(guān)于益生菌對TLR-NF-κB信號通路的具體調(diào)控機制不甚清晰，進一步研究其調(diào)控機理對于益生菌在人和動物中的應(yīng)用有非常重要的意義。

4 益生菌對不同細(xì)胞TLR-NF-κB信號通路的影響

4.1 對巨噬細(xì)胞TLR-NF-κB信號通路的影響

巨噬細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞中的一種，在機體免疫調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。一些益生菌分泌的可溶性因子可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的TLR-NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，避免機體組織損傷。Jang等[21]用脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，通過乳酸桿菌G-101處理后可以降低巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6以及IL-1β的分泌量，進而減緩炎癥反應(yīng)。Matsumoto等[22]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳酸桿菌可以下調(diào)了NF-κB的活性，抑制處于炎癥狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對IL-6的分泌。除此之外，還有研究表明一些益生菌可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，例如屎腸球菌可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-10，而干酪乳酸桿菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12[23]。

4.2 對上皮細(xì)胞TLR-NF-κB信號通路的影響

TLR-NF-κB信號通路是益生菌與不同上皮細(xì)胞作用的中樞，益生菌或其分泌物可以通過降低NF-κB的活性或者抑制IκB的降解來調(diào)控上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Wang等[24]報道，植物乳桿菌可以抑制IκB的降解來減輕TNF引發(fā)的炎癥反應(yīng)。Sokol等[25]研究發(fā)現(xiàn)，普拉梭菌DSM17677能夠抑制IL-1β引起的NF-κB活性，唾液鏈球菌也可抑制TLR-NF-κB信號通路的發(fā)生，下調(diào)IL-8的分泌來防止炎癥反應(yīng)。劉明超[26]研究發(fā)現(xiàn)用大腸桿菌感染奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞會上調(diào)NF-κB2和p65的總蛋白表達，而通過鼠李糖乳桿菌GR-1預(yù)處理細(xì)胞抑制了這2類蛋白的表達，說明鼠李糖乳桿菌GR-1能夠通過衰減MyD88依賴性和非依賴性信號傳遞途徑的信號傳導(dǎo)，加強NOD樣受體(NLR)和TLR之間的相互作用，進而減少炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-18、TNF-ɑ和IL-6等的釋放，從而抑制大腸桿菌誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Mihai等[27]用乳酸桿菌處理豬腸上皮細(xì)胞，最后發(fā)現(xiàn)用乳酸桿菌處理的豬腸上皮細(xì)胞比未用乳酸桿菌處理的IL-6、IL-8表達量低，而IL-6、IL-8是由TLR4介導(dǎo)經(jīng)TLR-NF-κB信號通路產(chǎn)生的炎性因子，說明乳酸桿菌可以抑制TLR-NF-κB信號通路的傳遞。徐敏等[28]通過建立結(jié)腸炎小鼠模型，觀察小鼠各種免疫指標(biāo)來研究3株益生菌對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的影響，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工模型結(jié)腸炎小鼠腸組織中的NF-κB p65蛋白表達量相對較高，說明已經(jīng)引起小鼠結(jié)腸炎癥狀。而通過益生菌治療以后NF-κB p65蛋白表達量顯著降低，IκB表達量顯著升高，進一步說明益生菌可以通過抑制TLR-NF-κB信號通路來降低小鼠機體炎癥。Zhang等[29]在研究鼠李糖乳桿菌LGG時發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過降低IκB的降解速率來抑制TLR-NF-κB信號通路，使NF-κB進入細(xì)胞核減少從而導(dǎo)致IL-8表達水平下降。Lee等[30]用葡萄糖硫酸鈉(DSS)來刺激小鼠使小鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，經(jīng)過檢測植物乳桿菌HY115和短乳桿菌HY7401可以起到抗炎癥的作用。在小鼠體內(nèi)DSS可以刺激IKK復(fù)合物，使IκB降解與NF-κB分開，這時NF-κB迅速進入細(xì)胞核調(diào)控炎性因子mRNA的表達，使小鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。而試驗證明植物乳桿菌HY115和短乳桿菌HY7401可以通過抑制IκB的磷酸化來降低NF-κB的活化，進而抑制IL-1β、TNF-α等mRNA的表達，降低炎癥反應(yīng)。然而，并不是所有的益生菌都能夠抑制NF-κB活化，Matsuguchi等[31]研究發(fā)現(xiàn)存在一些益生菌如乳酸桿菌YIT9029和發(fā)酵乳桿菌YIT0159不但不能夠抑制NF-κB的活化，反而對NF-κB有刺激作用，進而分泌TNF-α加重炎癥反應(yīng)。

5 小 結(jié)

近年來關(guān)于TLR、NF-κB以及TLR-NF-κB信號通路的研究已經(jīng)非常深入，TLR-NF-κB信號通路對動物機體炎癥的產(chǎn)生有非常重要的作用，對于TLR-NF-κB信號通路的阻斷策略也引起生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)界研究人員的高度重視。市面上已經(jīng)有許多NF-κB的抑制劑，但是一般會伴有不明的副作用，特異性差，無法對疾病進行有效的治療。益生菌作為飼料添加劑已經(jīng)有非常多的應(yīng)用，除了其增加腸道菌群豐度、改善腸道健康和提高免疫力的作用外，有大量研究表明特定的益生菌可以作為TLR-NF-κB信號通路的抑制劑，有效治療炎癥疾病。但是益生菌對TLR-NF-κB信號通路具體的抑制機制還不甚明確，而且益生菌對TLR-NF-κB信號通路抑制存在特異性。在以后的研究工作中，可以著重研究益生菌對TLR-NF-κB信號通路的抑制機理，以及不同益生菌對TLR-NF-κB信號通路抑制效果。