計 偉 謝春艷 趙艷平 肖定福*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省豬場廢棄物無害化處理與資源化利用工程研究中心，長沙 410128；3.雙胞胎(集團)股份有限公司，漳州雙胞胎飼料有限公司，南昌 341000)

在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)模式中，氧化應(yīng)激、腸道屏障受損及免疫力低等因素易導(dǎo)致豬生長緩慢、飼料利用率低及腹瀉等問題，嚴重影響?zhàn)B豬企業(yè)的經(jīng)濟效益。盡管抗生素添加能夠改善上述問題，但長期濫用抗生素將不可避免地造成抗生素殘留、細菌耐藥性等問題。抗生素作為飼料添加劑將逐漸被限制或者禁止，益生菌作為潛在的抗生素替代品具有廣闊的應(yīng)用前景。乳酸菌(Lactobacillus)作為益生菌的一種，是一類革蘭氏陽性的厭氧或者兼性厭氧微生物，主要通過發(fā)酵過程產(chǎn)生乳酸，通過改善腸道微生物平衡、增強抗氧化防御系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫、保持腸道屏障功能等發(fā)揮功能性作用，但其實際應(yīng)用效果并不明顯。本文綜述了乳酸菌在胃腸道內(nèi)生存的耐受性、生物學(xué)功能及其對哺乳仔豬、斷奶仔豬和母豬的影響，并總結(jié)了引起其應(yīng)用效果不穩(wěn)定的可能因素。

1 乳酸菌在胃腸道內(nèi)生存的耐受性

益生菌到達腸道之前需在胃酸存活4 h或更長時間。因此，酸和膽汁鹽的耐受性是選擇益生菌菌株的重要標準之一。耐酸性是由乳酸菌維持細胞內(nèi)pH[1]、保存細胞膜功能[2]或誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)蛋白[3]等決定的；膽汁鹽耐受性是由膽汁酸/鹽的主動外排、膽汁鹽水解[4]和細胞膜的改變等因素決定的[5]。研究表明，干酪乳桿菌(L.casei)誘導(dǎo)參與碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)表達，通過提供能量以抵抗酸應(yīng)激[6]。從仔豬腸道分離的植物乳桿菌(L.plantarum)ZlP001接種到含有0.1%、0.3%及0.5%膽汁酸的培養(yǎng)基，其耐受性依次為85.3%、61.4%及9.4%，并且該菌株對模擬胃液和腸液具有耐受性[7]。因此，通過體外篩選具有耐受胃腸道生存的菌株，有利于其在動物腸道內(nèi)生長繁殖。

2 乳酸菌的生物學(xué)功能

2.1 維持腸道微生態(tài)平衡

致病菌能否黏附在上皮細胞刷狀緣上是決定能否感染宿主的關(guān)鍵。研究表明，乳酸菌在人克隆結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2)細胞系中達到80%的黏附性[8]。腸道內(nèi)的副干酪乳桿菌(L.paracasei)BGSJ2-8產(chǎn)生的胞外多糖能黏附腸上皮細胞，并降低大腸桿菌與Caco-2結(jié)合[9]；L.plantarum與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)時，對后者的生長有87%的抑制作用[10]。乳酸菌黏附性是其定植動物腸道內(nèi)生長繁殖的前提，而其黏附性取決于菌體自身結(jié)構(gòu)、分泌物以及宿主細胞表面的相應(yīng)受體。發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)3872的膠原結(jié)合蛋白與腸道上皮細胞上Ⅰ型膠原蛋白結(jié)合，并且確定是一種黏附素參與結(jié)合[11]。乳酸菌黏附定植于腸道，可能是通過菌體表面的脂磷壁酸、肽聚糖及胞外多糖等黏附素與腸黏膜上特定模式識別受體結(jié)合[12]，而這種結(jié)合有利于緩解腸道蠕動對其產(chǎn)生的排除作用。

腸道微生物間相互競爭腸道上皮細胞刷狀緣上的附著點，高黏附性的有益菌能阻止致病菌對上皮細胞的黏附和侵入。德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)GG和L.fermentumI5007等均能夠通過排斥、競爭或者置換作用抑制大腸桿菌、沙門氏菌、念球菌等致病菌在宿主腸道內(nèi)黏附定植[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，L.rhamnosusGG通過降低念珠菌黏附在黏膜的附著力和消耗葡萄糖來緩解其對上皮損傷[15]，表明乳酸菌能夠優(yōu)先利用腸道中營養(yǎng)資源和爭奪黏附位點形成一層生物屏障，導(dǎo)致致病菌餓死和無法定植被排出體外。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌代謝產(chǎn)生的細菌素抑制革蘭氏陽性菌生長繁殖[16]；約氏乳桿菌(L.johnsonii)NCC533在體內(nèi)代謝產(chǎn)生過氧化氫，有效抑制沙門氏菌的生長繁殖[17]；羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)I5007是通過在腸道代謝產(chǎn)生乳酸來改變腸道pH，阻礙致病菌的定植[18]。以上研究表明乳酸菌能抑制致病菌生長繁殖。因此，乳酸菌在腸道內(nèi)大量的定植和繁殖，并通過自身代謝產(chǎn)物影響一些致病微生物在腸道內(nèi)的定植，從而維持腸道微生態(tài)平衡。

2.2 抗氧化防御作用

正常情況下，動物體內(nèi)自由基產(chǎn)生或清除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。一旦這種平衡被打破會造成自由基在體內(nèi)大量蓄積，過量的自由基破壞組織中DNA、脂質(zhì)等生物大分子，造成氧化應(yīng)激損傷。目前，大多研究學(xué)者認為乳酸菌抗氧化作用模式主要包括清除自由基、螯合金屬離子、具有還原能力、抑制脂質(zhì)氧化和提高抗氧化酶活性等。體外研究表明，L.plantarumZLP001具有清除超氧自由基以及羥基自由基的能力[19]；L.fementumME-3可通過減少金屬離子和脂質(zhì)過氧化來提高整體抗氧化水平[20]；L.plantarumC88飼喂由D-半乳糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的小鼠，可提高肝臟及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性和總抗氧化能力(T-AOC)，降低肝臟中丙二醛(MDA)含量[21]。因此，飼糧中添加乳酸菌可維持動物體內(nèi)自由基動態(tài)平衡，緩解氧化應(yīng)激的損傷。

2.3 腸道屏障功能與免疫力

腸道微生物的建立對動物腸道免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。外源乳酸菌對維持腸道結(jié)構(gòu)和屏障的完整性有積極影響。據(jù)報道，以L.reuteriD8作為外源因素對腸道干細胞有生物學(xué)影響，L.reuteriD8通過激活芳香烴受體，進而誘導(dǎo)固有層淋巴細胞分泌白細胞介素(interleukin，IL)-22，隨后激活信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3的磷酸化以加速腸道干細胞再生，并恢復(fù)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF)-α損失的腸道上皮結(jié)構(gòu)[22]。上調(diào)腸道閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(occludin)和閉合蛋白(claudins)的mRNA表達，穩(wěn)定緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和分布，改善腸道屏障功能[23]。也有研究表明，乳酸菌進入腸道后，可能是通過影響其他微生物區(qū)系或介導(dǎo)代謝產(chǎn)物及自身產(chǎn)生的免疫促進劑來調(diào)節(jié)腸道免疫[24-26]。L.rhamnosus引起IL-10的合成，進而抑制TNF-α、干擾素(interferon，IFN)-γ等致炎因子的分泌來調(diào)節(jié)免疫功能[24]；唾液乳桿菌(L.salivarius)LA307緩解小鼠結(jié)腸炎癥，而瑞士乳桿菌(L.helveticus)PI5維護腸道上皮屏障[26]。此外，L.reuteri和一群促進耐受性的免疫細胞的產(chǎn)生之間存在關(guān)聯(lián)。將L.reuteri移植到無菌小鼠的體內(nèi)時，食物中添加色氨酸含量對小鼠產(chǎn)生免疫細胞有著積極影響[27]，意味著某些氨基酸和腸道微生物并不是獨立存在的。目前某些氨基酸與腸道菌群的相互作用這一領(lǐng)域正備受研究者們關(guān)注，正在為腸道黏膜免疫機制以及干預(yù)策略提供全新的線索和思路。

3 乳酸菌在母豬和仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 乳酸菌在哺乳仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

新出生仔豬腸道基本是無菌狀態(tài)，出生24 h內(nèi)，腸道內(nèi)定植雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌等細菌，細菌的豐富度和多樣性與日齡呈正相關(guān)。因此，早期干預(yù)仔豬腸道微生物的建立對其腸道健康至關(guān)重要。研究表明，外源L.fermentum在仔豬早期生活中，提高十二指腸和空腸的絨毛高度與隱窩深度，并提高空腸中ZO-1和occludin的mRNA表達，維護腸道形態(tài)和腸黏膜通透性，改善腸道屏障功能，有效緩解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌應(yīng)激誘導(dǎo)的新生仔豬腹瀉[28]。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，試驗的第14天，在仔豬中觀察到結(jié)腸梭菌屬數(shù)量減少，空腸中絨毛高度增加，結(jié)腸中丁酸鹽和脂肪酸濃度增加，回腸中IL-1β的mRNA表達降低。用L.fermentumI5007飼喂仔豬后，其血液中CD4+T細胞亞群比例和回腸INF-γ含量增加，并降低了腹瀉率[29]。Zhang等[30]報道，L.salivarius能夠顯著上調(diào)哺乳仔豬的β防御素-2的分泌，增強腸道化學(xué)屏障功能。由于幼齡仔豬消化和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，仔豬腸道缺乏足夠的酸來幫助消化食物以及容易受到致病菌感染引起腹瀉。乳酸菌促進哺乳仔豬新陳代謝和營養(yǎng)物質(zhì)吸收，并改善腸道健康[31]。研究表明，哺乳仔豬口服L.case，提高了仔豬胃、十二指腸和結(jié)腸中蛋白酶活性以及血漿中免疫球蛋白A(IgA)含量[32]。因此，外源乳酸菌能有效增強哺乳仔豬胃腸道功能，可能是通過誘導(dǎo)微生物群落的最佳組成，改善腸道屏障功能，提高免疫力，預(yù)防病原體感染。

3.2 乳酸菌在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

近年來，乳酸菌在改善斷奶仔豬生長性能和腸道健康方面受到廣泛關(guān)注。在斷奶應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬通常會出現(xiàn)采食量減少、腸道消化酶活性降低和腹瀉等情況，其主要因素是腸道微生態(tài)平衡被破壞[33]。張董燕等[34]發(fā)現(xiàn)，以0.75%豬源羅伊氏乳酸桿菌作為仔豬飼料添加劑，平均日增重提高了20.07%，料重比降低了14.90%。Wang等[35]也表明，飼糧中添加1×109CFU/d的L.plantarumZJ316，平均日增重提高了20.45%，飼料轉(zhuǎn)化率提高了21.07%。也有報道指出外源乳酸菌對仔豬生長性能無顯著影響[36]。已知乳酸菌具有菌株特異性，可能會影響細菌和宿主的相互作用。這種菌株對于宿主來說是非內(nèi)源性，在腸道內(nèi)存活數(shù)量低，不能形成優(yōu)勢菌群，難起到益生作用。研究表明，乳酸菌可替代仔豬的抗生素[37]，L.fermentumI5007通過提高與能量代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、免疫反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)水平來緩解斷奶應(yīng)激綜合征[38]。用不同菌株的乳酸菌飼喂斷奶仔豬后，其血清中免疫球蛋白M(IgM)和IFN-γ含量增加[39]；空腸和回腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌量增加[40]；并促進了IgA分泌，降低了回腸IL-8分泌，緩解了沙門氏菌感染而導(dǎo)致的炎癥[41]；上調(diào)了ZO-1、occludin和claudins的mRNA表達[23]，穩(wěn)定緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和分布，減少腸道黏膜通透性，改善腸道健康。此外，斷奶應(yīng)激與氧化應(yīng)激相關(guān)，氧化應(yīng)激被認為是影響腸道健康和功能的主要因素之一。研究表明，L.plantarumZLP001提高斷奶仔豬血清中SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(CAT)活性，降低血清中MDA含量[19]，改善抗氧化功能。因此，飼糧中添加乳酸菌能夠改善斷奶仔豬生長性能、免疫力和抗氧化等功能，緩解了斷奶應(yīng)激。

3.3 乳酸菌在母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

腸道菌群結(jié)構(gòu)變化參與宿主代謝的調(diào)控，包括氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。研究表明，高產(chǎn)母豬妊娠后期和泌乳期出現(xiàn)DNA氧化損傷和血液中抗氧化物質(zhì)含量減少等情況[42]。任紅立等[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加乳酸菌與酵母菌的復(fù)合菌顯著提高了母豬血漿中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇的含量，降低了血漿中MDA含量，并提高了仔豬出生窩重，改善了母豬繁殖性能、血漿脂質(zhì)代謝和抗氧化能力。母豬妊娠后期腸道微生物會發(fā)生不同程度的紊亂，而腸道微生物的紊亂可能會使腸腔中活性氧產(chǎn)生增多，后者對結(jié)腸上皮細胞的DNA造成損傷。而有些腸道共生菌如某些種類的乳酸菌具有抗氧化作用，能夠抑制活性氧的產(chǎn)生。L.paracaseiFn032、L.rhamnosusGG等都能夠抑制結(jié)腸食糜發(fā)酵過程中氧自由基的產(chǎn)生并能夠抑制大腸桿菌的生長[44]。已知新生仔豬的高死亡率通常與由大腸埃希氏菌、沙門氏菌、輪狀病毒和冠狀病毒感染引起的腹瀉有關(guān)。而仔豬對抗感染的免疫力主要是通過初乳的免疫球蛋白和細胞因子來建立。細胞因子已被證明對腸道黏膜發(fā)揮局部作用，并穿透循環(huán)系統(tǒng)，影響仔豬胃腸道共生微生物的定植[45]。研究表明，飼喂益生菌影響母豬腸道菌群[46]，影響初乳的組成[47]。Wang等[48]報道，妊娠期母豬飼糧中添加乳酸菌顯著增加仔豬出生、斷奶窩重及血清免疫球蛋白G(IgG)含量，改善仔豬腸道微生物的多樣性[49]。因此，母豬妊娠后期飼糧中添加乳酸菌類益生菌緩解自身代謝紊亂，可能通過改變母豬妊娠期腸道菌群與初乳的組成而影響新生仔豬的被動免疫與腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，促進仔豬腸道健康。

4 小 結(jié)

綜上所述，外源乳酸菌在母豬和仔豬生產(chǎn)中的功能及應(yīng)用主要通過以下2個途徑：1)改變母豬妊娠期腸道菌群與初乳的組成而影響新生仔豬的被動免疫與腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，促進仔豬腸道健康；提高斷奶仔豬抗氧化和腸道屏障與免疫，緩解斷奶應(yīng)激；2)緩解母豬妊娠期的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。乳酸菌等益生菌在實際應(yīng)用效果并不理想，其主要原因有以下幾點： 1)乳酸菌的生產(chǎn)技術(shù)條件要求極高，難以培養(yǎng)，所以市場上基本沒有實用型的飼用乳酸菌產(chǎn)品供應(yīng)。2)在實際儲存過程中，自然損失和失活率非常高。同時，在顆粒飼料生產(chǎn)過程中，無包埋保護處理的乳酸菌在經(jīng)過80 ℃以上處理后基本損失殆盡。3)應(yīng)用效果同使用的菌株的數(shù)量密切相關(guān)，在腸道內(nèi)數(shù)量低不能形成優(yōu)勢菌群，難起到益生作用。乳酸菌等益生菌用于特定養(yǎng)殖動物所需要的菌群數(shù)量尚無統(tǒng)一的規(guī)定。因此，飼用乳酸菌添加劑好壞的關(guān)鍵在于乳酸菌的有效含量、是否包埋、耐熱、耐存儲、耐制粒等，以及通過體外篩選具有耐受胃腸道生存的菌株，只要有考慮到以上因素，才能更好地發(fā)揮其應(yīng)用效果。此外，將活的乳酸菌應(yīng)用于飼料中，其潛在的致病性、抗藥基因轉(zhuǎn)移的可能性及繁殖和變異的不可控制性都是需要注意的。