?；?常 杰 胡宗福 王思珍

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，通遼 028000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年玉米籽粒消費(fèi)量的60%以上用于飼料，但生產(chǎn)玉米的秸稈卻未被高效利用，造成種植業(yè)副產(chǎn)品的飼料轉(zhuǎn)化利用難度高、效率低。從提高資源的綜合利用率、減少污染、提高產(chǎn)品的附加值等各方面考慮，秸稈的綜合利用十分必要[1]。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略性調(diào)整和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，大力推進(jìn)全株青貯玉米種植、發(fā)展反芻動(dòng)物養(yǎng)殖相結(jié)合的“種植-養(yǎng)殖-種植”模式、積極實(shí)施“糧改飼”降本增效項(xiàng)目是解決飼料資源短缺問(wèn)題和人畜爭(zhēng)糧矛盾的重要舉措。為提高和改善反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，更好地使全株玉米、苜蓿牧草等轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)的飼料，利用青貯微生物發(fā)酵技術(shù)，添加有益微生物來(lái)改善青貯飼料的品質(zhì)是非常重要的措施之一[2]。本文從近年來(lái)國(guó)內(nèi)外青貯微生物研發(fā)和利用的現(xiàn)狀出發(fā)，結(jié)合最新研究進(jìn)展，將青貯微生物技術(shù)、種類及微生物接種劑對(duì)青貯飼料的作用機(jī)理、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性、動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響進(jìn)行概述，為進(jìn)一步改善青貯飼料品質(zhì)和提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用參考。

1 青貯微生物新菌種的認(rèn)識(shí)與鑒定

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)，如PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)、16S rRNA高通量第2代454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、第3代單分子測(cè)序技術(shù)、宏基因組(metagenomics)、轉(zhuǎn)錄組(metatranscriptomic)等，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)微生物多樣性和結(jié)構(gòu)組成[2-6]。Han等[7]利用PCR-DGGE檢測(cè)全混合日糧青貯飼料中微生物菌群，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了耐酸乳桿菌 (Lactobacillusacetotolerans)和腦橋乳桿菌(L.pontis)菌株。Li等[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)在青貯過(guò)程中檢測(cè)到30多個(gè)菌屬群落結(jié)構(gòu)的變化情況。劉晶晶[9]應(yīng)用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)柳枝稷青貯60 d后的微生物多樣性。陶蓮等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段和Miseq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，能夠在分析青貯品質(zhì)的同時(shí)，提供青貯前后整個(gè)菌落構(gòu)成及豐度變化的信息，進(jìn)而為發(fā)酵過(guò)程的調(diào)控提供依據(jù)。Bao等[11]利用第3代單分子測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)苜蓿青貯前后微生物的變化及菌落對(duì)苜蓿品質(zhì)的影響，可用于評(píng)估青貯飼料微生物變化和質(zhì)量。本課題組采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析了全株玉米青貯發(fā)酵和暴露空氣過(guò)程中的微生物變化規(guī)律及菌落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)短期暴露空氣可增加有害菌——梭菌的繁殖[12]。隨著傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和不斷發(fā)展的PCR新技術(shù)的結(jié)合，青貯飼料中新的菌種正在不斷被認(rèn)識(shí)和利用，這些新的菌種被分離、篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)后接種到青貯飼料中，再采用PCR-DGGE、高通量測(cè)序、宏基因組等方法闡明菌種對(duì)青貯發(fā)酵的作用，這是發(fā)掘和利用青貯微生物新菌種行之有效的方法和措施。

近年來(lái)，青貯飼料中分離的微生物菌種如表1所示，通過(guò)了解這些微生物新種類的生物生長(zhǎng)和發(fā)酵特性，可以篩選出對(duì)青貯飼料品質(zhì)有益的種類，作為青貯微生物接種劑，同時(shí)，可以查找出對(duì)青貯有害的微生物，作為研究青貯抑制菌的參考。

表1 青貯飼料中分離的微生物菌種

續(xù)表1微生物種類Microbial species青貯類型Silage type引用文獻(xiàn)References畢赤酵母菌 Pichia deserticola青貯玉米Li等[24]奧默畢赤酵母 Pichia kudriavzevii青貯玉米Li等[24]發(fā)酵畢赤酵母 Pichia fermentans青貯玉米R(shí)ossi等[19]庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母 Pichia kudriavzevii青貯玉米Li等[24]假絲酵母 Candida apicola玉米、黑麥草Rossi等[19]中間假絲酵母 Candida intermedia青貯玉米Li等[24]光滑假絲酵母 Candida glabrata青貯玉米Li等[24]木蘭假絲酵母 Candida magnolia青貯玉米Li等[24]管道假絲酵母 Candida mesenterica青貯玉米R(shí)ossi等[19]

Wu等[13]在青貯苜蓿中分離出了食果糖乳桿菌(L.fructivorans)。王紅梅等[14]從呼倫貝爾草原牧草青貯飼料中分離得到5株乳酸菌菌株，分別為乳桿菌屬和片球菌屬(Pediococcusspp.)的植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糊精片球菌(Pediococusdextrinicus)、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)和草乳桿菌(L.graminis)，其中植物乳桿菌產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵速度最快，耐酸和耐低溫能力較強(qiáng)，適宜用作呼倫貝爾地區(qū)青貯飼料乳酸菌添加劑的菌種。Wang等[18]從青貯飼料中分離出新的菌種并命名為臺(tái)灣乳桿菌(L.taiwanensis)。Rossi等[19]調(diào)查了農(nóng)場(chǎng)的青貯飼料，主要是青貯玉米、苜蓿、黑麥草及其青貯玉米和玉米粒的混合物，除分離青貯玉米中已知的乳酸菌外，還發(fā)現(xiàn)了新菌種——玉米乳桿菌(L.zeae)；同時(shí)在這些青貯飼料中被發(fā)現(xiàn)的厭氧芽孢梭菌屬中，除了巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和軟化類芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)，其他大部分是已知的梭菌；在這些青貯飼料中，管道假絲酵母(Candidamesenterica)、假絲酵母(C.apicola)和畢赤酵母菌(Pichiafermentans)3種酵母種類被鑒定，其中管道假絲酵母、假絲酵母是首次被報(bào)道。Brusetti等[22]采用長(zhǎng)度多態(tài)片段-PCR(LH-PCR)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),青貯玉米早期存在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)(發(fā)酵0和1 d)、魏斯氏乳酸菌(Weissellakimchi)(發(fā)酵6 d)和黃色腸球菌(Enterococcusflavescens)(發(fā)酵13 d)，這些菌種是首次在青貯飼料中報(bào)道。

2 青貯微生物接種劑作用機(jī)理及應(yīng)用效果

2.1 青貯微生物接種劑常用種類及作用機(jī)制

青貯微生物接種劑通常分為4類：1)同型發(fā)酵乳酸菌，可快速降低pH、增加乳酸菌數(shù)量和乳酸含量；2)專性異型發(fā)酵乳酸菌，主要具有增加有氧穩(wěn)定性的作用；3)兼性異型發(fā)酵乳酸菌，具有兩者聯(lián)合的作用；4)其他微生物接種劑，也就是非乳酸菌接種劑(N-LAB)，如新型的微生物接種劑牛鏈球菌(Streptococcusbovis)-同型乳酸菌聯(lián)合、丙酸桿菌(Propionibacterium)、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌(yeast)，以上青貯微生物接種劑主要有促進(jìn)發(fā)酵、抑制有氧惡化、改善營(yíng)養(yǎng)和吸收等作用[23]。為彌補(bǔ)青貯原料附生菌(小于105CFU/g鮮物質(zhì))的不足，更好地促進(jìn)青貯發(fā)酵，在制作青貯飼料時(shí)，應(yīng)該添加菌劑使青貯飼料中發(fā)酵菌種不少于105CFU/g鮮質(zhì)量，使青貯環(huán)境pH降低加快，更快進(jìn)入發(fā)酵期。其作用機(jī)制是創(chuàng)造一個(gè)封閉的厭氧環(huán)境，添加適宜的微生物接種劑結(jié)合附著在牧草上的乳酸菌，可加快青貯發(fā)酵速度，增強(qiáng)乳酸菌的快速繁殖，使pH快速降低到3.8以下，產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸能有效抑制其他微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而最大限度地減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高牧草的能量轉(zhuǎn)化率，保持牧草鮮綠、芳香氣味的感官特性,改善反芻動(dòng)物的適口性[2]。因此，在青貯飼料發(fā)酵調(diào)制過(guò)程中，添加適宜的接種菌劑可加快青貯發(fā)酵速度，改善青貯品質(zhì)，提高其利用率，增強(qiáng)有氧穩(wěn)定性，有效提高動(dòng)物的采食量。

2.2 青貯微生物接種劑對(duì)青貯飼料品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

近20年來(lái)，在世界大部分地區(qū)微生物接種劑已廣泛應(yīng)用。青貯微生物接種劑產(chǎn)品大部分是同型發(fā)酵乳酸菌接種劑，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌、糞鏈球菌(E.faecium)、片球菌等。添加微生物接種劑的目的是在青貯發(fā)酵過(guò)程中快速、高效生產(chǎn)乳酸，可使pH更快降低，減少干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的損失，保持青貯原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)。然而，研究發(fā)現(xiàn)使用這些產(chǎn)品對(duì)青貯全株玉米有氧穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，這可能是因?yàn)橐宜岬臏p少。目前尋找一種同型發(fā)酵乳酸菌，既能以有機(jī)酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物，又能保持青貯飼料不變敗的微生物接種劑是業(yè)內(nèi)非常迫切的需求。

異型發(fā)酵乳酸菌來(lái)自于乳酸桿菌科中乳酸桿菌屬，如布氏乳桿菌(L.buchneri)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、乳球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏菌(Weissella)。布氏乳桿菌作為代表的微生物接種劑被廣泛應(yīng)用，該菌株生長(zhǎng)緩慢，即使在發(fā)酵期結(jié)束后也能從糖或乳酸中產(chǎn)生乙酸，乙酸的增加可以抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，延緩青貯飼料腐敗變質(zhì)，進(jìn)而改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。然而，這種微生物接種劑也存在一些缺陷，相比同型發(fā)酵乳酸菌，其生長(zhǎng)較為緩慢，需要青貯50～70 d才能改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，因此，在青貯中添加布氏乳桿菌的特殊菌株和接種量還需要進(jìn)一步研究，來(lái)彌補(bǔ)這些缺陷[25]。最近研究表明，新型的布氏乳桿菌-A KKP 2047p能將1,2-丙二醇轉(zhuǎn)化為丙酸，這有助于葡萄糖和維生素B12的生成[26]，但是青貯中天然存在的該菌株是否有這種轉(zhuǎn)化能力尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。布氏乳桿菌與傳統(tǒng)的微生物接種劑聯(lián)合應(yīng)用，既可提高青貯飼料的品質(zhì)和動(dòng)物的生產(chǎn)性能，又能改善其有氧穩(wěn)定性。Guo等[27]利用單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序技術(shù)和代謝組學(xué)檢測(cè)在紫花苜蓿中添加同型發(fā)酵植物乳桿菌和異型發(fā)酵布氏乳桿菌的青貯飼料細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化和代謝特征，為青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中微生物變化提供了生物信息，也為添加不同類型的微生物接種劑生產(chǎn)不同品質(zhì)的青貯飼料提供了調(diào)控方法。

兼性和專性異型發(fā)酵乳酸菌聯(lián)合應(yīng)用是一個(gè)微生物接種劑產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)2種類型有益作用的重要途徑之一。兼性異型發(fā)酵乳酸菌控制發(fā)酵期間梭菌等有害菌的生成，降低粗蛋白質(zhì)的水解和干物質(zhì)的損失。專性異型發(fā)酵乳酸菌大部分布氏乳桿菌種類在青貯發(fā)酵后期由乳酸轉(zhuǎn)變乙酸較慢，可提高青貯pH和有氧穩(wěn)定性，從而使飼喂的動(dòng)物在日增重和產(chǎn)奶量等生產(chǎn)性能上獲得提升。然而，目前飼喂添加聯(lián)合微生物接種劑的青貯飼料可以持續(xù)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用尚不清楚。體外消化研究表明，青貯可以改善纖維的消化作用[28]，但在反芻動(dòng)物體內(nèi)是否有類似的有益作用還需進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

對(duì)于新的微生物接種劑，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)與乳酸菌菌株在青貯使用中的作用非常相似，它是在瘤胃中認(rèn)知和篩選的，而不是在青貯中發(fā)現(xiàn)的乳酸菌種，生長(zhǎng)繁殖非常快，20 min可增倍生長(zhǎng)，比青貯乳酸菌菌種繁殖快。Ferreira等[29]在實(shí)驗(yàn)室微貯象草中添加2株牛鏈球菌株進(jìn)行60 d青貯，與未添加和添加糞腸球菌比較，牛鏈球菌株不僅降低了pH和氨氮含量，還減少了氣體和液體物的損失，從而增加了青貯干物質(zhì)含量，因此，這2種菌株有望成為潛在的青貯熱帶牧草的接種菌株。枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是一種新開發(fā)的菌種，可通過(guò)產(chǎn)生具有抑制酵母和霉菌的細(xì)菌素來(lái)提高有氧穩(wěn)定性，已在青貯玉米[30]和青貯苜蓿中應(yīng)用。最近，酵母菌如畢赤酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為一種新的青貯微生物接種劑已被報(bào)道[31]，具有抑制青貯有害菌的生成和減少有氧損失的作用，但是在青貯應(yīng)用中很難控制其生長(zhǎng)繁殖，這是阻礙其商業(yè)化的主要原因之一。研究表明，一些新發(fā)現(xiàn)的微生物接種劑可產(chǎn)生抗菌和抗霉菌化合物，能夠抑制多種青貯中有害菌和霉菌生成，為提升青貯飼料質(zhì)量和減少青貯飼料使用過(guò)程中有害菌、有害物質(zhì)生成提供了寶貴的微生物資源[30-31]。

2.3 青貯微生物接種劑對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響

青貯微生物接種劑的添加對(duì)青貯飼料品質(zhì)具有積極的作用，而且可提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。然而，目前有關(guān)青貯微生物接種劑提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的機(jī)理仍不清楚，在某些情況下，青貯飼料品質(zhì)與動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有明顯的關(guān)系，但大部分是間接的關(guān)系，青貯飼料干物質(zhì)消化率的改善與動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高可能有關(guān)。Ando等[32]研究發(fā)現(xiàn)，添加鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)青貯幾內(nèi)亞牧草，可提高干物質(zhì)和有機(jī)物的消化率，增加閹割公羊的攝食量。最近研究表明，青貯飼料添加菌劑可以改善動(dòng)物的體外發(fā)酵。水稻全混合日糧接種植物乳桿菌株的體外研究表明，與未經(jīng)處理的全混合日糧青貯飼料相比，減少了甲烷的產(chǎn)生[33]。Ellis等[34]添加乳酸菌作為益生菌和發(fā)酵劑可增加瘤胃體外消化率，減少甲烷氣體的產(chǎn)生。Daniel等[35]添加混合同型發(fā)酵劑乳明串珠菌(L.lactis)、植物乳桿菌和屎腸球菌(E.faecium)接種玉米青貯飼料，可提高奶牛全混合日糧的消化率，并增加產(chǎn)奶量。這些結(jié)果表明，一些菌劑可以改變瘤胃發(fā)酵，無(wú)論是降低甲烷的產(chǎn)生還是增加瘤胃微生物的生物量，任何一種方式都可能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)者來(lái)說(shuō)，提高生產(chǎn)效率是在青貯飼料中添加微生物接種劑的主要目的。但青貯微生物接種劑對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)效率的影響了解甚少。因此，研究青貯微生物接種劑對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響是篩選和發(fā)掘微生物接種劑的關(guān)鍵，應(yīng)該選擇可能增強(qiáng)瘤胃微生物活性的菌株，而不是在青貯期間只降低纖維素的菌株。當(dāng)然，基于PCR新技術(shù)、代謝組學(xué)與體外發(fā)酵進(jìn)行分析[27，36-37]，將有助于我們進(jìn)一步深入研究和揭示青貯接種乳酸菌如何影響反芻動(dòng)物的利用和生產(chǎn)性能。

4 結(jié)論與展望

我國(guó)對(duì)青貯飼料的研究起步較晚，特別是青貯微生物接種劑產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用，與發(fā)達(dá)國(guó)家存在很大差距，這與我國(guó)“糧改飼”、反芻動(dòng)物由粗放生產(chǎn)向集約化生產(chǎn)轉(zhuǎn)變的發(fā)展是極不相適的。近幾年來(lái)，我國(guó)奶牛、肉牛、肉羊等反芻動(dòng)物生產(chǎn)突飛猛進(jìn)，均需要優(yōu)質(zhì)青貯飼料作為物質(zhì)保障，但落后的青貯技術(shù)和缺少優(yōu)質(zhì)的青貯微生物接種劑，成了制約反芻動(dòng)物生產(chǎn)和降本增效的主要因素。隨著對(duì)青貯飼料品質(zhì)需求的提升和化學(xué)腐蝕性青貯添加劑使用的減少，選擇無(wú)毒、無(wú)害、廉價(jià)、使用方便的青貯微生物接種劑是我國(guó)青貯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的勢(shì)趨。目前，國(guó)外青貯微生物接種劑應(yīng)用多年，也已進(jìn)入我國(guó)青貯市場(chǎng)，而我國(guó)還沒(méi)有自主研發(fā)的優(yōu)質(zhì)青貯微生物接種劑產(chǎn)品，所以亟待加強(qiáng)這方面的研究和開發(fā)。我們需采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)(尤其是16S rRNA高通量第3代單分子和全基因測(cè)序技術(shù)、宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等不斷更新的技術(shù))，不斷認(rèn)知青貯飼料資源中的新菌種，分離獲得優(yōu)良的微生物接種劑，為進(jìn)一步改善青貯飼料品質(zhì)和提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用新思路。