姚小波，王文峰，李 楊，劉何春，雷雪萍，龐 博，次仁央拉

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院，西藏 拉薩 850000)

大麥黃矮病(Barley Yellow Dwarf Virus，簡稱BYDV)是最重要、分布最廣的禾谷類病毒[1]，包括小麥和燕麥等禾谷類作物的主要病害之一。大麥黃矮病病毒由蚜蟲以持續(xù)性方式傳播，病毒在蚜蟲體內(nèi)可存活2～3周，感染植株的韌皮部組織后，細胞大量增殖[2]，引起葉片增厚、發(fā)黃。依據(jù)蚜蟲傳播效率與介體?；?，將BYDV劃分成PAV、MAV、RMV、SGV、RPV 5個株系，不同株系由不同種類麥蚜傳播[3]。每種蚜蟲只對其中的1個株系最有效，麥二叉蚜專化性傳播SGV分離物，麥長管蚜專化性傳播MAV分離物，禾谷縊管蚜?；詡鞑PV分離物，禾谷縊管蚜和麥長管蚜兩種蚜蟲均能有效傳播PAV分離物，玉米蚜能有效傳播RMV分離物[4]。在我國，Zhou等[5]鑒定出GPV、GAV、PAV和RMV 4種株系。我國大麥黃矮病株系主要有RPV、GAV、PAV 3種，禾谷級管蚜傳播的RPV株系；麥二叉蚜、麥長管蚜傳播的GAV株系；禾谷縊管蚜和麥長管蚜傳播的PAV株系[6]，近幾年我國的主流株系為GAV株系。青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，又稱裸大麥，生產(chǎn)上大部分品種對BYDV抗性差，在西藏各冬、春青稞種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，拉薩、山南尤為嚴重。黃矮病一般造成青稞減產(chǎn)15 %左右，青稞早期發(fā)生黃矮病試驗記載平均損失為55 %，甚至可達100 %。

利用系統(tǒng)性殺蟲劑控制蚜蟲是減輕黃矮病傳播流行的重要方法，使用耐病或抗病品種是防治大麥黃矮病最有效的措施，因此明確不同地區(qū)大麥黃矮病毒株系，有針對性地培育抗耐病品種是十分必要的。近年來，西藏拉薩、山南麥黃矮病發(fā)生日趨嚴重，而關(guān)于該地區(qū)大麥黃矮病毒株系類型、介體蚜蟲傳毒能力尚未見報道。本文對西藏青稞的黃矮病病株進行了血清學鑒定和介體蚜蟲傳毒能力分析，以期明確該區(qū)域的大麥黃矮病毒株系類型和蚜蟲傳毒能力，為我區(qū)青稞抗黃矮病育種工作和田間防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 青稞田蚜蟲種類調(diào)查

從秋季開始至第2年夏結(jié)束，從拉薩曲水縣、山南桑日縣青稞黃矮病發(fā)生區(qū)定點系統(tǒng)調(diào)查。5點取樣,不定期從田間采集蚜蟲，實驗室隔離標記飼養(yǎng)，進行種類鑒定。

1.2 病株采集與保存

2016年5月10～15日，從拉薩、山南不同發(fā)病區(qū)采集典型新鮮病株，選取山南桑日縣冬青稞(冬青18)疑似病株4份，編號sn1、sn2、sn3、sn4；選取拉薩曲水縣冬青稞(冬青18)疑似病株6份，編號ls1、ls2、ls3、ls4、ls5、ls6，用于病毒株系鑒定。

1.3 生物學測定

1.3.1 傳毒蚜蟲及毒源 在無毒青稞苗上飼養(yǎng)試驗蚜蟲，所產(chǎn)若蚜連續(xù)多代飼養(yǎng)獲得無毒蚜蟲，作為實驗蚜蟲。BYDV-GAV毒源由課題組采集、分離、保存。

1.3.2 飼毒與接種 試驗盆種植冬青稞冬青18，養(yǎng)蟲籠隔離培植無毒苗。用無毒蚜取食感毒青稞，在15 ℃、黑暗條件下，培養(yǎng)2 d獲毒，幼苗2葉期接種感毒成蚜蟲3頭，傳毒3 d，噴灑殺蟲劑吡蟲啉徹底殺死接種麥苗上蚜蟲，以不接蟲為對照(CK)，充分發(fā)病后調(diào)查病株率。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測定

PAV、SGV、RPV、GAV抗血清由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所病毒組提供，飽和硫酸銨法提純IgG，用堿性磷酸酯酶標記IgG，采用雙夾心酶聯(lián)免疫吸附方法(即DAS-ELISA法)[7]。接種PAV和GAV株系的青稞感病品種“冬青18”為陽性對照，它們的健株為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥黃矮病的田間癥狀及蚜蟲種類鑒定

感病植株葉片從葉邊緣、葉尖或葉片中間出現(xiàn)不均勻退色斑，褪色區(qū)域呈鮮黃色，點片狀不均勻褪色是黃矮病最典型特征之一[8]。一般從新葉下1～2片葉開始黃化，自上而下，自葉尖沿葉脈向葉身擴展，逐漸變窄、變厚、質(zhì)脆，葉背有蠟質(zhì)光澤。拔節(jié)期發(fā)病，植株不矮化。孕穗期發(fā)病，僅葉發(fā)黃，自尖端向下逐漸延伸，根系不健全，主根短，次生根少(圖1)。

經(jīng)拉薩、山南多點、多次田間采樣及室內(nèi)飼養(yǎng)，通過體形、體色、腹管、翅中脈、尾片毛(根)等形態(tài)特征鑒別，主要有麥長管蚜[Sitobion avenae(Fabricius)]、禾谷縊管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnaeus)]和麥無網(wǎng)長管蚜[Metopolophiumdirhodum(Walker)]3種(圖2)。

2.2 大麥黃矮病病毒株系血清學鑒定

利用BYDV-PAV、GAV、RPV抗血清對待測10份標樣株系測定，以毒源GAV、RPV、PAV分離物為陽性對照，健康麥葉作為陰性對照。經(jīng)鑒定，拉薩曲水6份樣本與GAV抗血清有強反應，OD值在0.031～2.331之間，平均為1.102，陰性健株對照值0.027，GAV陽性對照1.034，而與RPV、PAV 2種抗血清無反應，曲水青稞上黃矮病病毒流行株系為GAV。山南桑日縣4份標樣與毒源GAV、RPV、PAV分離物抗血清無特異反應，標樣無我國大麥黃矮病流行株系。

圖1 西藏大麥黃矮病的田間癥狀

圖2 西藏常見3種麥蚜

圖3 電泳檢測結(jié)果

2.3 RT-PCR驗證

以標樣總RNA為模板，陽性對照為陽性質(zhì)粒，陰性對照為無菌水，設(shè)計大麥黃矮病GAV CP基因特異引物，進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，樣品和陽性對照呈現(xiàn)條帶，陰性對照無此條帶的出現(xiàn)(圖3)，BYDV ELISA檢測與RT-PCR驗證結(jié)果相符，GAV株系是拉薩大麥黃矮病主要株系。

2.4 蚜蟲傳毒能力比較

拉薩、山南3種蚜經(jīng)純化后，獲得無毒的麥無網(wǎng)長管蚜、麥長管蚜、禾谷縊管蚜，在相同的條件下，飼毒接種，第25天開始發(fā)病到第40天病癥明顯。拉薩、山南兩地的麥無網(wǎng)長管蚜、禾谷縊管蚜不傳播GAV株系黃矮病病毒。麥長管蚜對黃矮病GAV株系的傳毒能力強，拉薩、山南兩地麥長管蚜傳GAV株系的能力無差異。

3 結(jié) 論

我們對西藏地區(qū)的10份樣品經(jīng)血清學鑒定，拉薩曲水采集6份冬青18樣本為黃矮病，經(jīng)DAS-ELISA法檢測，RT-PCR法驗證，拉薩曲水青稞黃矮病病毒株系為GAV株系。西藏拉薩、山南麥蚜種群田間調(diào)查，該地區(qū)蚜蟲種群為麥無網(wǎng)長管蚜、麥長管蚜、禾谷縊管蚜。傳播的GAV株系的媒介昆蟲是麥長管蚜，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)大量的禾谷縊管蚜、麥無網(wǎng)長管蚜，是大麥黃矮病其它株系媒介昆蟲，是否存在其它病毒株系，尚需多點采樣進一步分離鑒定。

表1 常見麥蚜的鑒別特征

表2 ELISA檢測結(jié)果

表3 拉薩、山南3種蚜蟲成蚜傳播GAV株系能力比較表

注：傳毒能力用發(fā)病株數(shù)與接種總株數(shù)的比值表示。