凌淑萍，王全勝，付巖，張亮，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

井岡霉素(jingangmycin)是一種由吸水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的水溶性抗生素——葡萄糖苷類化合物[1]，共有A、B、C、D、E、F六種組分，農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的井岡霉素中，井岡霉素A的含量最高，約占60%；井岡霉素B約占15%，剩余部分為井岡霉素的其他組分[2]。井岡霉素為廣譜抗真菌劑，具有良好的防治植物病害的作用，年產(chǎn)超過(guò)6萬(wàn)t，產(chǎn)值超過(guò)4億元，可供近6 700億m2農(nóng)田使用[3]。通常作物中井岡霉素的提取可以通過(guò)甲醇與水(9∶1)溶劑提取，或通過(guò)10%氨水溶液提取；井岡霉素的初步提取液可通過(guò)固相萃取柱進(jìn)行純化。目前井岡霉素的定量法最低檢出量可達(dá)到0.4 ng，平均回收率均超過(guò)70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.1%～13.6%[4-8]。

中國(guó)是中醫(yī)藥的起源地，是中藥材的生產(chǎn)和應(yīng)用大國(guó)。白術(shù)為我國(guó)常用中藥之一，為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，性溫，味甘、苦[9]，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，用于治療脾胃氣弱、泄瀉、汗出、胎動(dòng)不安等。近年來(lái)，井岡霉素及其復(fù)配試劑常用來(lái)防治白術(shù)重要病害，如斑枯病，立枯病和白絹病等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)井岡霉素報(bào)道比較少，中國(guó)、CAC、歐盟、美國(guó)及日本均未制定白術(shù)上井岡霉素的最大殘留值。隨著井岡霉素在白術(shù)上應(yīng)用的普及，白術(shù)又是用于孕婦安胎的常見中藥之一，建立合適的檢測(cè)方法也變得尤為重要。本研究擬建立了一種在白術(shù)中井岡霉素殘留量的檢測(cè)方法，為有效監(jiān)控井岡霉素在白術(shù)上的殘留風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS(Waters)、備色譜柱Acquity UPLC BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)、恒溫振蕩器(IKA KS4000ic)、高速離心機(jī)(Sigma 3K15)、高速勻漿機(jī)(IKA T25)、旋渦混合器(IKA GENIUS3)、烘箱(STIK BAO-112A)、離心管、電子天平以及其他實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備等。井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品86.4%，購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所；乙腈、甲醇、乙酸銨為色譜純；HLB SPE小柱購(gòu)于Waters。

1.2 樣品前處理方法

稱取樣品(白術(shù)鮮樣5 g，白術(shù)植株和干樣各4 g)置于50 mL離心管中，加入20.0 mL 90%甲醇水溶液，高速勻漿1 min后，9 500 r·min-1離心3 min，取上清液，殘?jiān)偌尤?0.0 mL 90%甲醇水溶液，高速勻漿1 min后，9 500 r·min-1離心3 min，合并2次上清液，在45 ℃條件下氮?dú)獯抵? mL以下，待凈化。

依次用6 mL甲醇、6 mL純水活化6 mL HLB SPE小柱，將氮?dú)獯颠^(guò)的剩余樣品全部上樣，再用4 mL純水清洗試管，清洗液全部上樣，收集所有流出液，用純水定容至8.5 mL，再加入1.5 mL乙腈混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。將井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品2.028 mg用純水定容至25 mL，配制成70.09 mg·kg-1的母液，再用純水稀釋成10、1、0.1 mg·L-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，與4 ℃避光保存，有效期為6個(gè)月。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制。將白術(shù)植株、鮮樣和干樣空白樣品按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行處理，得到3種空白基質(zhì)溶液，再將母液分別配制成濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg·L-1的系列白術(shù)植株、鮮樣和干樣基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 分析測(cè)定

色譜條件。流動(dòng)相為5 mmol·L-1乙酸銨、pH值4.5(A)和乙腈(B)。采用梯度淋洗，具體如表1。色譜柱柱溫35 ℃，樣品室溫度10 ℃，進(jìn)樣體積10.0 μL。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件。由表2可知，采用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，電離電壓2.50 kV，霧化氣流速550 L·h-1，錐孔氣流速50 L·h-1，源溫150 ℃，霧化溫度500 ℃。

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

注：*為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

將井岡霉素標(biāo)樣溶液用空白樣品(基質(zhì))提取液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)工作溶液。在上述儀器條件下進(jìn)樣檢測(cè)，井岡霉素的保留時(shí)間為0.7 min左右，得到MS響應(yīng)值(峰面積，Y)與進(jìn)樣濃度(X)的線性回歸方程。

白術(shù)植株基質(zhì)。當(dāng)井岡霉素進(jìn)樣濃度為0.01～1.00 mg·L-1時(shí)，二者呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，Y=6 044X-19。

白術(shù)基質(zhì)(鮮樣)。當(dāng)井岡霉素進(jìn)樣濃度為0.01～1.00 mg·L-1時(shí)，二者呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，Y=9 314X-114。

白術(shù)基質(zhì)(干樣)。當(dāng)井岡霉素進(jìn)樣濃度為0.01～1.00 mg·L-1時(shí)，二者呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為1.000，Y=8 071X-17。

綜上所述，在白術(shù)鮮樣、干樣和植株基質(zhì)中，當(dāng)井岡霉素進(jìn)樣濃度為0.01～1.00 mg·L-1時(shí)，MS響應(yīng)值與進(jìn)樣濃度線性關(guān)系良好。以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度0.01 mg·L-1、進(jìn)樣量10 μL計(jì)算，可得井岡霉素的最小檢測(cè)量為1.0×10-10g。

2.2 添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

按上述色譜條件及檢測(cè)步驟，進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，井岡霉素在白術(shù)植株、鮮樣和干樣中的添加濃度均為0.05～2.00 mg·kg-1，每個(gè)濃度重復(fù)5次。如表3所示，井岡霉素于白術(shù)植株中的平均回收率為85.5%～107.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為7.2%；井岡霉素于白術(shù)鮮樣中的平均回收率為95.4%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為5.9%；于白術(shù)干樣中的平均回收率為82.4%～98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為8.1%。以最小添加濃度0.05 mg·kg-1作為最低檢出濃度，因此井岡霉素在白術(shù)植株、鮮樣和干樣中最低檢出濃度均為0.05 mg·kg-1。回收率和RSD均在農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則允許范圍內(nèi)，方法重復(fù)性良好，可滿足殘留量分析要求。

表3 白術(shù)中井岡霉素的添加回收率

3 小結(jié)

本研究建立了一種白術(shù)上的殘留分析方法，并對(duì)建立的方法進(jìn)行了考察，包括線性、檢出限、回收率和精密度等，能夠分別對(duì)白術(shù)植株、鮮樣和干樣樣品中的井岡霉素進(jìn)行定性定量檢測(cè)，方法快速、高效、靈敏，且能夠滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，為有效監(jiān)控白術(shù)中井岡霉素提供可靠的技術(shù)支持。