武云鵬 ,張若緯 ,彭冬秀 ,張秀婷
(1.天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所 天津 300381; 2.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 天津 300462)
甜瓜(Cucumis meloL.)是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物,其香氣怡人,肉質(zhì)酥脆多汁,并富含維生素、蛋白質(zhì)等,深受消費(fèi)者喜愛。隨著人們生活水平的提高,對(duì)高品質(zhì)甜瓜的需求逐年增加。但是,常規(guī)育種周期長,易受環(huán)境因素影響,制約了育種進(jìn)程。近年來,隨著基因工程等先進(jìn)的技術(shù)在育種工作中的應(yīng)用,將目的基因?qū)胩鸸?,加快甜瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新,改善甜瓜品質(zhì),已成為甜瓜育種的新途徑?;蚬こ痰燃夹g(shù)的應(yīng)用,需建立高效的再生體系。筆者以甜瓜子葉、胚軸、真葉為外植體,總結(jié)出適合甜瓜離體培養(yǎng)的激素種類、濃度,并制定一套完整的甜瓜高效離體再生體系,為甜瓜基因工程提供技術(shù)保障。
試驗(yàn)于2016—2018年在天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,‘花雷’甜瓜種子由天津科潤蔬菜研究所提,IAA、6-BA、IBA由Solarbio提供,分析軟件為SPSS。
1.2.1 無菌苗的獲得 將甜瓜種子放入無菌水中浸泡4 h后剝?nèi)シN殼,無菌條件下放入75%(φ)酒精中浸泡30 s,無菌蒸餾水沖洗4~5次,再次浸泡在2%NaClO溶液15 min,無菌蒸餾水沖洗4~5次,用無菌濾紙吸干水分后,然后接種于MS培養(yǎng)基上(蔗糖30 g·L-1,瓊脂 7 g·L-1,pH 值 5.8),置于恒溫 26 ℃、光強(qiáng)1 600 lx、光照16 h、黑暗8 h的環(huán)境中生長。
1.2.2 愈傷組織和不定芽誘導(dǎo) 將7 d苗齡的無菌苗子葉在無菌條件下切成5 mm×5 mm小塊,胚軸切成5 mm小段,15 d苗齡的真葉切成5 mm×5 mm小塊,分別接種于表2的9組培養(yǎng)基中,每種外植體接種10瓶,每瓶4個(gè)外植體。30 d后統(tǒng)計(jì)外植體出愈率和出芽率。
1.2.3 不定芽分化 切取1.2.2獲得的綠色、疏松不定芽接種于16組分化培養(yǎng)基中,每個(gè)不定芽接種10瓶,每瓶4個(gè)不定芽。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化頻率。
1.2.4 生根培養(yǎng) 叢生芽生長至1.5~2 cm時(shí),從基部切下,轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。
由表1可知,子葉、胚軸、真葉均可誘導(dǎo)出愈傷組織,子葉、胚軸誘導(dǎo)率 100%,真葉誘導(dǎo)率僅為40%。其中,子葉在接種5 d后明顯膨大至原來3倍左右(圖1),同時(shí)發(fā)生卷曲,葉脈處顏色變淡,接種30 d后愈傷組織大量緊密,有許多綠色凸起;胚軸接種10 d后兩端變鈍,顏色逐漸變淺,接種30 d后形成疏松淡黃色愈傷組織;真葉接種后膨大緩慢并且顏色變淺,接種30 d后呈現(xiàn)淡黃色愈傷組織,繼續(xù)培養(yǎng)10 d后,愈傷組織褐化。說明子葉在這3種外植體中誘導(dǎo)愈傷組織速度快,長出的愈傷組織緊密、綠色,最適合組織離體培養(yǎng)。
表1 不同外植體出愈情況
圖1 子葉接種誘導(dǎo)培養(yǎng)基5 d
將子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,由表2可知,當(dāng)IAA 濃度較低時(shí)(1、2、3號(hào)培養(yǎng)基),隨著 6-BA 濃度的增加,愈傷組織的質(zhì)量逐漸下降;當(dāng)6-BA濃度較低時(shí)(1、4、7號(hào)培養(yǎng)基),隨著IAA濃度的增加,愈傷組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,由緊密變?yōu)槭杷?,顏色變化較大,當(dāng) IAA 質(zhì)量濃度較高時(shí)(2.0 mg·L-1),愈傷組織已經(jīng)發(fā)生褐化。由此可見,當(dāng)子葉接種于低濃度6-BA、IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中時(shí)(1號(hào)培養(yǎng)基),其愈傷組織發(fā)生最快且組織結(jié)構(gòu)緊密,顏色為綠色,并有許多凸起。
表2 子葉在9種愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長情況
子葉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10 d后,其表面產(chǎn)生許多小突起,20 d后小突起形成叢生芽(圖2),30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織表面叢生芽的數(shù)量,結(jié)果如表2所示。對(duì)誘導(dǎo)的平均芽數(shù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果表明,由于培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑不同造成分生芽數(shù)量差異顯著。這說明生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度差異是影響不定芽分化的關(guān)鍵因素。從出芽率和平均每塊愈傷的出芽數(shù)等因素綜合考慮,選擇MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA 為誘導(dǎo)子葉愈傷組織和不定芽的最佳培養(yǎng)基。
圖2 子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽
切取愈傷組織上的不定芽,接種在分化培養(yǎng)基中(表3)10 d后,不定芽開始分化,30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化數(shù)量(圖3)。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí),隨著IBA濃度的增加,部分不定芽產(chǎn)生不定根;而當(dāng)IBA濃度很小時(shí),隨著6-BA濃度的增加,不定芽停止分化,但玻璃化隨之加重,當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時(shí),不定芽褐化。利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,由于生長調(diào)節(jié)劑濃度不同,導(dǎo)致不定芽分化數(shù)量差異顯著。因此,綜合出芽率等因素考慮,MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA 為芽分化最佳培養(yǎng)基,這與趙燕[1]等人的研究成果相一致。
表3 16組分化培養(yǎng)基對(duì)不定芽分化的影響
圖3 不定芽分化
由表4可知,當(dāng)MS培養(yǎng)基中不添加任何激素時(shí),在不定芽莖基部產(chǎn)生少量愈傷組織,因此,添加一定量的IBA有利于根的發(fā)生。隨著IBA濃度的增高,不定根數(shù)量隨之增多,當(dāng)IBA濃度為0.2 mg·L-1時(shí),最有利于根的生長(圖4)。
表4 不同濃度生根培養(yǎng)基對(duì)生根影響
圖4 不定芽生根
筆者對(duì)薄皮甜瓜‘花雷’的子葉、胚軸、真葉進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)對(duì)比,在接種30 d后3種外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織,子葉出愈速度快,組織緊密、綠色,有許多凸起;胚軸出愈速度慢,組織疏松、淺黃色;而真葉出愈速度最慢,且褐化嚴(yán)重。因此子葉被作為誘導(dǎo)甜瓜不定芽發(fā)生的首選外植體[2],這與喬永旭[3]、魏曉明等[4]的研究結(jié)果一致。
培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的配比是影響甜瓜子葉再生頻率的關(guān)鍵因素之一,在不同濃度組合的6-BA與IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,子葉的再生頻率和平均再生芽數(shù)差異很大,本試驗(yàn)結(jié)果表明,適合甜瓜子葉誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA,這與付秋實(shí)等[5]的試驗(yàn)結(jié)果不相符,有可能是由于不同甜瓜品種內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑含量不同導(dǎo)致的結(jié)果不一致。在不定芽分化過程中,當(dāng)6-BA濃度很低時(shí),隨著6-BA濃度的增加,不定芽分化率變化較大,反之變化較小,所以正如前人研究所述,6-BA對(duì)甜瓜不定芽的分化起決定性作用[1]。在生根培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基添加了IBA,因?yàn)镮BA主要用于促進(jìn)扦插生根,其引起的不定根多而細(xì)長。試驗(yàn)證明,生根培養(yǎng)基以培養(yǎng)基MS+0.2 mg·L-1IBA為最佳組合。張慧君等[6]在生根培養(yǎng)時(shí)選擇不添加任何激素的MS培養(yǎng)基,生根率 100%;施先鋒等[7]認(rèn)為,在 1/2MS+0.1 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中最易生根,盛慧等[8]認(rèn)為,生根培養(yǎng)基最佳組合為1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1。由于試驗(yàn)條件所限,未能對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行更深一步研究,因此,在今后試驗(yàn)過程中,嘗試不同生根培養(yǎng)基,以求更高效地培養(yǎng)出再生苗。