武云鵬 ，張若緯 ，彭冬秀 ，張秀婷

（1.天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室·蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室·天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所 天津 300381； 2.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 天津 300462）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生植物，其香氣怡人，肉質(zhì)酥脆多汁，并富含維生素、蛋白質(zhì)等，深受消費(fèi)者喜愛。隨著人們生活水平的提高，對高品質(zhì)甜瓜的需求逐年增加。但是，常規(guī)育種周期長，易受環(huán)境因素影響，制約了育種進(jìn)程。近年來，隨著基因工程等先進(jìn)的技術(shù)在育種工作中的應(yīng)用，將目的基因?qū)胩鸸?，加快甜瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新，改善甜瓜品質(zhì)，已成為甜瓜育種的新途徑?；蚬こ痰燃夹g(shù)的應(yīng)用，需建立高效的再生體系。筆者以甜瓜子葉、胚軸、真葉為外植體，總結(jié)出適合甜瓜離體培養(yǎng)的激素種類、濃度，并制定一套完整的甜瓜高效離體再生體系，為甜瓜基因工程提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016—2018年在天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所實驗室進(jìn)行，‘花雷’甜瓜種子由天津科潤蔬菜研究所提，IAA、6-BA、IBA由Solarbio提供，分析軟件為SPSS。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 將甜瓜種子放入無菌水中浸泡4 h后剝?nèi)シN殼，無菌條件下放入75%（φ）酒精中浸泡30 s，無菌蒸餾水沖洗4～5次，再次浸泡在2%NaClO溶液15 min，無菌蒸餾水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水分后，然后接種于MS培養(yǎng)基上（蔗糖30 g·L-1，瓊脂 7 g·L-1，pH 值 5.8），置于恒溫 26 ℃、光強(qiáng)1 600 lx、光照16 h、黑暗8 h的環(huán)境中生長。

1.2.2 愈傷組織和不定芽誘導(dǎo) 將7 d苗齡的無菌苗子葉在無菌條件下切成5 mm×5 mm小塊，胚軸切成5 mm小段，15 d苗齡的真葉切成5 mm×5 mm小塊，分別接種于表2的9組培養(yǎng)基中，每種外植體接種10瓶，每瓶4個外植體。30 d后統(tǒng)計外植體出愈率和出芽率。

1.2.3 不定芽分化 切取1.2.2獲得的綠色、疏松不定芽接種于16組分化培養(yǎng)基中，每個不定芽接種10瓶，每瓶4個不定芽。30 d后統(tǒng)計不定芽分化頻率。

1.2.4 生根培養(yǎng) 叢生芽生長至1.5～2 cm時，從基部切下，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳外植體確定

由表1可知，子葉、胚軸、真葉均可誘導(dǎo)出愈傷組織，子葉、胚軸誘導(dǎo)率 100%，真葉誘導(dǎo)率僅為40%。其中，子葉在接種5 d后明顯膨大至原來3倍左右（圖1），同時發(fā)生卷曲，葉脈處顏色變淡，接種30 d后愈傷組織大量緊密，有許多綠色凸起；胚軸接種10 d后兩端變鈍，顏色逐漸變淺，接種30 d后形成疏松淡黃色愈傷組織；真葉接種后膨大緩慢并且顏色變淺，接種30 d后呈現(xiàn)淡黃色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，愈傷組織褐化。說明子葉在這3種外植體中誘導(dǎo)愈傷組織速度快，長出的愈傷組織緊密、綠色，最適合組織離體培養(yǎng)。

表1 不同外植體出愈情況

圖1 子葉接種誘導(dǎo)培養(yǎng)基5 d

2.2 誘導(dǎo)子葉的最佳培養(yǎng)基

將子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，由表2可知，當(dāng)IAA 濃度較低時（1、2、3號培養(yǎng)基），隨著 6-BA 濃度的增加，愈傷組織的質(zhì)量逐漸下降；當(dāng)6-BA濃度較低時（1、4、7號培養(yǎng)基），隨著IAA濃度的增加，愈傷組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，由緊密變?yōu)槭杷?，顏色變化較大，當(dāng) IAA 質(zhì)量濃度較高時（2.0 mg·L-1），愈傷組織已經(jīng)發(fā)生褐化。由此可見，當(dāng)子葉接種于低濃度6-BA、IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中時（1號培養(yǎng)基），其愈傷組織發(fā)生最快且組織結(jié)構(gòu)緊密，顏色為綠色，并有許多凸起。

表2 子葉在9種愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長情況

子葉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10 d后，其表面產(chǎn)生許多小突起，20 d后小突起形成叢生芽（圖2），30 d后統(tǒng)計愈傷組織表面叢生芽的數(shù)量，結(jié)果如表2所示。對誘導(dǎo)的平均芽數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，由于培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑不同造成分生芽數(shù)量差異顯著。這說明生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度差異是影響不定芽分化的關(guān)鍵因素。從出芽率和平均每塊愈傷的出芽數(shù)等因素綜合考慮，選擇MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA 為誘導(dǎo)子葉愈傷組織和不定芽的最佳培養(yǎng)基。

圖2 子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽

2.3 不定芽分化的最佳培養(yǎng)基

切取愈傷組織上的不定芽，接種在分化培養(yǎng)基中（表3）10 d后，不定芽開始分化，30 d后統(tǒng)計不定芽分化數(shù)量（圖3）。當(dāng)6-BA濃度一定時，隨著IBA濃度的增加，部分不定芽產(chǎn)生不定根；而當(dāng)IBA濃度很小時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽停止分化，但玻璃化隨之加重，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時，不定芽褐化。利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，由于生長調(diào)節(jié)劑濃度不同，導(dǎo)致不定芽分化數(shù)量差異顯著。因此，綜合出芽率等因素考慮，MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA 為芽分化最佳培養(yǎng)基，這與趙燕[1]等人的研究成果相一致。

表3 16組分化培養(yǎng)基對不定芽分化的影響

圖3 不定芽分化

2.4 生根培養(yǎng)

由表4可知，當(dāng)MS培養(yǎng)基中不添加任何激素時，在不定芽莖基部產(chǎn)生少量愈傷組織，因此，添加一定量的IBA有利于根的發(fā)生。隨著IBA濃度的增高，不定根數(shù)量隨之增多，當(dāng)IBA濃度為0.2 mg·L-1時，最有利于根的生長（圖4）。

表4 不同濃度生根培養(yǎng)基對生根影響

圖4 不定芽生根

3 討論

3.1 外植體的選擇

筆者對薄皮甜瓜‘花雷’的子葉、胚軸、真葉進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)對比，在接種30 d后3種外植體均能誘導(dǎo)出愈傷組織，子葉出愈速度快，組織緊密、綠色，有許多凸起；胚軸出愈速度慢，組織疏松、淺黃色；而真葉出愈速度最慢，且褐化嚴(yán)重。因此子葉被作為誘導(dǎo)甜瓜不定芽發(fā)生的首選外植體[2]，這與喬永旭[3]、魏曉明等[4]的研究結(jié)果一致。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的配比是影響甜瓜子葉再生頻率的關(guān)鍵因素之一，在不同濃度組合的6-BA與IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，子葉的再生頻率和平均再生芽數(shù)差異很大，本試驗結(jié)果表明，適合甜瓜子葉誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA，這與付秋實等[5]的試驗結(jié)果不相符，有可能是由于不同甜瓜品種內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑含量不同導(dǎo)致的結(jié)果不一致。在不定芽分化過程中，當(dāng)6-BA濃度很低時，隨著6-BA濃度的增加，不定芽分化率變化較大，反之變化較小，所以正如前人研究所述，6-BA對甜瓜不定芽的分化起決定性作用[1]。在生根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基添加了IBA，因為IBA主要用于促進(jìn)扦插生根，其引起的不定根多而細(xì)長。試驗證明，生根培養(yǎng)基以培養(yǎng)基MS+0.2 mg·L-1IBA為最佳組合。張慧君等[6]在生根培養(yǎng)時選擇不添加任何激素的MS培養(yǎng)基，生根率 100%；施先鋒等[7]認(rèn)為，在 1/2MS+0.1 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中最易生根，盛慧等[8]認(rèn)為，生根培養(yǎng)基最佳組合為1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1。由于試驗條件所限，未能對生根培養(yǎng)基進(jìn)行更深一步研究，因此，在今后試驗過程中，嘗試不同生根培養(yǎng)基，以求更高效地培養(yǎng)出再生苗。