吳宇佳，吉清妹，解 鈺，雷 菲，鄭道君

（海南省耕地保育重點實驗室·農(nóng)業(yè)部海南耕地保育科學觀測實驗站·海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所 ?？?571100）

連作障礙是指在同一塊土壤中連續(xù)種植同一種作物或者是近緣作物時，即使在正常的栽培管理條件下，也會出現(xiàn)生長變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降甚至死秧的現(xiàn)象[1]。近年來，西瓜種植面積普遍較大，且呈現(xiàn)大規(guī)模的專業(yè)化發(fā)展趨勢，由于耕地面積匱乏，西瓜連作已不可避免。然而，連作障礙問題嚴重制約著西瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。西瓜嫁接技術目前已經(jīng)大面積推廣，主要解決了西瓜連作障礙問題，但也增加了育苗成本，同時由于西瓜嫁接苗在其些品質(zhì)或性狀上受砧木的影響從而對西瓜的品質(zhì)和生長發(fā)育造成影響。所以，解決西瓜連作障礙應從連作本身進行研究。由于連作形成了特殊的土壤環(huán)境，土壤有益微生物減少、有害微生物增加，導致土傳病害加重[2-3]，根際微生物種群失衡，多樣性水平降低，病原拮抗菌減少[4-8]，病蟲危害加重，土壤養(yǎng)分利用率降低。

近年來發(fā)現(xiàn)的ERIC序列是存在于原核生物基因組中的一類短的重復序列。該序列在染色體上的分布和拷貝數(shù)具有種間特異性，根據(jù)序列中心高度保守的44 bp的ERIC核心序列設計反向引物，可擴增出反映細菌基因組結構特征的譜帶。由于ERIC-PCR快速簡便，圖譜重復性好，適用于細菌分類鑒定、環(huán)境監(jiān)測、污染治理以及人和動物腸道菌群結構研究等方面[9]。

筆者采用ERCI-PCR技術，研究連作西瓜在不同茬數(shù)和不同生育期土壤細菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)之間的差異，并探討土壤細菌群落指數(shù)在同一茬數(shù)4個不同時期的變化趨勢，旨在闡述連作茬數(shù)及不同生育期對土壤細菌群落結構及組成分布的影響，同時也為今后選擇適宜的時期，人為引入有益的土壤微生物等措施調(diào)整土壤微生態(tài)環(huán)境，發(fā)揮有益微生物的作用，抑制病原菌發(fā)展，提高西瓜抗病能力與品質(zhì)，為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供重要科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與西瓜品種

試驗地點為海南省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所大棚，供試土壤是未種過瓜類的大棚菜田土，理化性質(zhì)為：堿解氮含量（w，下同）135.8 mg·kg-1、速效磷含量 169.15 mg·kg-1、速效鉀 91.11 mg·kg-1、有機質(zhì)1.39%、pH 5.98。供試西瓜品種為‘紅冠龍’。

1.2 試驗設計

西瓜種植模式為單行單壟，壟長15 m，寬1.3 m，覆蓋黑色地膜。試驗設3個重復，每壟為1個重復，對照不種作物，面積3 m×3 m。西瓜采用種子直播，連種3茬。

1.3 土壤取樣

取樣前，控制土壤濕度，在濕度相對一致時采樣。在不同生長期分別采取根際、非根際土樣和對照土樣于50 mL離心管中，-20℃條件下冷凍保存（表1）。

表1 供試土壤取樣情況

西瓜種植第3茬時，于成熟期發(fā)枯萎病死株，無法取樣。最終取得對照、根際、非根際共33個土壤樣品。

1.4 土壤微生物總DNA提取與PCR擴增

土壤微生物總DNA提取方法采用改良CTAB法[10]，以提取的土壤總DNA為模板進行ERCI-PCR擴增反應。ERCI引物序列按Versalovic J等(1991)報道的進行設計，即為 ERIC1R：5'-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3'；ERIC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'；20 μL反應體系：10×PCR buffer 2.0 μL，Mg2+濃度為 2.0 mmol·L-1，dNTPs 濃度為 200 μmol·L-1，2.0 UTaqDNA 聚合酶，30 ng 模板 DNA，正反引物濃度為 0.4 μmol·L-1，剩余體積用ddH2O補足至20 μL。按下述程序進行擴增：預變性 94℃ 4 min；變性 94℃ 30 s，退火47℃ 50 s，延伸 72℃ 120 s，35循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。反應重復1次。

8.0 %聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對照分子量標準：50 bp與 100 bp DNA Ladder，緩沖液 0.5×TBE，電壓 80～100 V，相機拍照并記錄結果。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1 ERCI-PCR數(shù)據(jù)分析 用Shannon-Weaver指數(shù)和其均勻度指數(shù)來表示群落DNA序列多樣性，通過ERIC-PCR電泳圖，按吳宇佳等[10]的 RAPD-PCR產(chǎn)物分析方法，計算 33個土樣細菌的ERIC-PCR產(chǎn)物、Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)，分析待測土樣的細菌多樣性變化。

Shaanon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)計算：

Dsh=-∑PilnPi=-∑(Ni/N)ln(Ni/N)，

Jsh=Dsh/lnS。

式中，Dsh表示Shannon-Weaver指數(shù)，Jsh表示均勻度指數(shù)，Pi表示第i個RAPD條帶出現(xiàn)的概率，Ni表示第i個RAPD條帶的擴增量，N表示土壤微生物群落DNA的RAPD條帶的擴增總量（N=∑Ni），S則表示群落DNA序列的豐富度指數(shù)。Dsh最小值0，最大值lnS。

采用DPS 6.0計算得Shannon-Weaver指數(shù)及均勻度指數(shù)。

1.5.2 土壤細菌指標分析 不同茬數(shù)不同生長時期土壤細菌多樣性指標間的差異比較、環(huán)境溫度與土壤細菌多樣性指標的相關性分析均用JPM 6.0統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 不同茬數(shù)、同一茬數(shù)不同生長時期的非根際土壤細菌多樣性變化

由圖版A（見彩色插頁第10頁）與表2可知，不同生長期非根際土壤微生物細菌多樣性的差異顯著，豐富度從 7～16，變異系數(shù)為 26.35%，Dsh在2.662 0～3.991 5之間，變異系數(shù)為12.30%；但不同生長期非根際土壤細菌的均勻度變化不大，變異系數(shù)僅為1.90%。其中，第1茬收獲期非根際土壤細菌生物多樣性最高，豐富度和Dsh分別為16和3.991 5；第1茬初果期最低，豐富度和Dsh分別為7和2.662 0，均勻度在此期也達到最小值。在3個茬口中，第1個茬口的平均Dsh為3.20，第 2個茬口的平均Dsh為14.27，第3個茬口的非根際土壤細菌多樣性隨之下降，平均Dsh為3.57。

為了驗證取樣溫度對非根際土壤細菌多樣性的影響，對取樣溫度與Dsh、Jsh和豐富度進行了相關性分析。結果表明，取樣溫度與Dsh、Jsh呈負相關，相關系數(shù)為：-0.587 6和-0.300 3，但負相關性不顯著，即p＞0.05；取樣溫度與豐富度呈負相關，相關系數(shù)為-0.604 1，且p＜0.05，負相關性顯著。可見，取樣溫度對非根際土壤細菌多樣性有較大的影響。

2.2 不同茬數(shù)、同一茬數(shù)不同生長期的根際細菌多樣性變化

由圖版B（見彩色插頁第10頁）、表2可知，西瓜連作后，西瓜根際土壤細菌多樣性發(fā)生了顯著變化，種群豐富度在7～16之間，變異系數(shù)達到30.31%；Dsh在2.678 6～3.960 0之間，變異系數(shù)為12.92%，但種群的均勻度變化不大。其中，第1茬伸蔓期和初果期的Dsh均較小，分別為2.678 6和2.680 3，均勻度在這2個時期也達到最小值。第1茬收獲期的根際細菌多樣性最為豐富，Dsh=3.960 0。

表2 西瓜連作對土壤細菌多樣性指數(shù)的影響

進一步的分析結果表明，取樣溫度與豐富度、Dsh、Jsh 呈負相關，相關系數(shù)分別為：-0.644 3、-0.389 1和-0.613 2，其中，負相關顯著的是Dsh和豐富度，p＜0.05。即取樣溫度對根際土壤細菌多樣性有較大的影響。

2.3 連作對同一茬數(shù)同一時期不同土樣影響的比較

對比分析結果表明，雖然取樣溫度對土壤細菌多樣性變化有較大影響，但從整體上看，所有樣品的根際土壤細菌Dsh（12.92%）和豐富度（30.31%）的變異系數(shù)均比對照土壤的高，非根際土壤的次之。此外，從表2和圖版C（見彩色插頁第10頁）中也可以看出，無論取樣溫度變化多大，每一生長時期的樣品中，根際土壤細菌多樣性均是最小的?？梢?，西瓜連作后，對細菌多樣性和群落結構影響大。

進一步分析表明，連作西瓜根際土壤在不同茬口不同生長時期的細菌多樣性差異較大，其中第2茬伸蔓期和第3茬初果期根際土壤細菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16），第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）對根際土壤細菌的多樣性影響也較大。但在第1茬初果期和收獲期對根際土壤細菌多樣性的影響基本沒有，CV僅分別為1.16%和1.71%，這可能是由于低溫所致，這2個時期取樣溫度分別為18.5℃和16.5℃。

3 討論

3.1 應用分子標記技術分析土壤微生物多樣性

分子標記技術被廣泛應用于土壤微生物群落結構、功能及動態(tài)監(jiān)測等方面。這些方法主要有：DGGE（變性梯度膠電泳技術）、TGGE（溫度梯度凝膠電泳）、ARDRA（16S rDNA的限制性片段長度多態(tài)性分析）、T-RFLPs（16S rDNA末端標記限制性片段長度多態(tài)性分析）、SSCP（單鏈構象多態(tài)性）、和ERIC-PCR（腸桿菌基因間的重復共有序列擴增圖譜分析）等方法。通過這些分子生態(tài)學技術，土壤管理者可根據(jù)實際情況，快速、準確、全面且有針對性地調(diào)理土壤微生物數(shù)目與種類，制定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施與耕作制度。

ERIC-PCR用于研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的結構，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離成微生物群落特有的條帶。條帶的數(shù)量、位置及亮度能反映出微生物群落結構的特征。ERIC-PCR技術重復性好、靈敏度高，可高效地動態(tài)監(jiān)測生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結構的變化[11]。1999年，科學家首次在混合菌群群落結構的分析上應用ERIC-PCR技術，得到的指紋圖譜能反映菌群組成差異且重復性、穩(wěn)定性好。之后，ERIC-PCR逐漸用于微生物群落的結構分析。在本研究中，ERIC分析亦較好地揭示了西瓜連作對根際土壤細菌多樣性的影響。應用ERIC-PCR技術研究土壤微生物群落結構具有操作簡單、硬件要求低等特點，具有較好的應用前景。

3.2 連作作物的土壤細菌多樣性

土壤微生物對植物土傳病害的抑制作用是在土壤微生物群體影響下完成的，并不是單一菌群作用的結果[12-13]。土壤中細菌數(shù)量是衡量土壤中微生物區(qū)系狀況的一個重要指標之一。相關研究表明，連作后土壤中細菌數(shù)量會下降，導致土壤類型由細菌型向真菌型轉(zhuǎn)變[14-16]。而另外一些研究顯示，部分作物連作后土壤細菌數(shù)量上升[17-18]。趙萌等[19]分析了西瓜連作對土壤主要微生物類群的影響，結果顯示，隨著連作茬數(shù)的增加，土壤細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量先升后降，真菌數(shù)量則相反。因此，開展連作作物土壤多樣性研究非常重要。在本研究中，雖然取樣溫度對土壤細菌多樣性變化有影響，但從整體上看，不管哪個時期，同一生長時期的根際土壤細菌多樣性均比非根際土壤和對照土樣的低。西瓜連作對不同茬口不同生長期根際土壤細菌多樣性的影響差異較大，ERIC分析結果表明，第2茬伸蔓期和第3茬初果期根際土壤細菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16%）、第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）對根際土壤的細菌多樣性影響也較大。對于連作西瓜土壤微生物中各類細菌數(shù)量的具體分析仍需深入探討。

4 結論

（1）ERIC-PCR技術可用于連作西瓜土壤微生物多樣性方面的研究。（2）不同生長期，連作西瓜的根際與非根際土壤細菌多樣性均有較大變化，Shannon-Weaver指數(shù)和豐富度指數(shù)的變異系數(shù)均在12%以上。（3）取樣溫度與連作西瓜根際、非根際細菌Shannon-Weaver指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)呈負相關，其中與豐富度指數(shù)呈顯著負相關，相關系數(shù)達0.60以上。（4）根際細菌多樣性影響在不同生長期是不一樣的，第3茬初果期影響最大，第2茬伸蔓期次之。第3茬初果期和第2茬伸蔓期根際土壤細菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達到10.91%和10.7%。