吳宇佳，吉清妹，解 鈺，雷 菲，鄭道君

（海南省耕地保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·農(nóng)業(yè)部海南耕地保育科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站·海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所 ?？?571100）

連作障礙是指在同一塊土壤中連續(xù)種植同一種作物或者是近緣作物時(shí)，即使在正常的栽培管理?xiàng)l件下，也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降甚至死秧的現(xiàn)象[1]。近年來(lái)，西瓜種植面積普遍較大，且呈現(xiàn)大規(guī)模的專業(yè)化發(fā)展趨勢(shì)，由于耕地面積匱乏，西瓜連作已不可避免。然而，連作障礙問(wèn)題嚴(yán)重制約著西瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。西瓜嫁接技術(shù)目前已經(jīng)大面積推廣，主要解決了西瓜連作障礙問(wèn)題，但也增加了育苗成本，同時(shí)由于西瓜嫁接苗在其些品質(zhì)或性狀上受砧木的影響從而對(duì)西瓜的品質(zhì)和生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。所以，解決西瓜連作障礙應(yīng)從連作本身進(jìn)行研究。由于連作形成了特殊的土壤環(huán)境，土壤有益微生物減少、有害微生物增加，導(dǎo)致土傳病害加重[2-3]，根際微生物種群失衡，多樣性水平降低，病原拮抗菌減少[4-8]，病蟲危害加重，土壤養(yǎng)分利用率降低。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的ERIC序列是存在于原核生物基因組中的一類短的重復(fù)序列。該序列在染色體上的分布和拷貝數(shù)具有種間特異性，根據(jù)序列中心高度保守的44 bp的ERIC核心序列設(shè)計(jì)反向引物，可擴(kuò)增出反映細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)特征的譜帶。由于ERIC-PCR快速簡(jiǎn)便，圖譜重復(fù)性好，適用于細(xì)菌分類鑒定、環(huán)境監(jiān)測(cè)、污染治理以及人和動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)研究等方面[9]。

筆者采用ERCI-PCR技術(shù)，研究連作西瓜在不同茬數(shù)和不同生育期土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)之間的差異，并探討土壤細(xì)菌群落指數(shù)在同一茬數(shù)4個(gè)不同時(shí)期的變化趨勢(shì)，旨在闡述連作茬數(shù)及不同生育期對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成分布的影響，同時(shí)也為今后選擇適宜的時(shí)期，人為引入有益的土壤微生物等措施調(diào)整土壤微生態(tài)環(huán)境，發(fā)揮有益微生物的作用，抑制病原菌發(fā)展，提高西瓜抗病能力與品質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與西瓜品種

試驗(yàn)地點(diǎn)為海南省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所大棚，供試土壤是未種過(guò)瓜類的大棚菜田土，理化性質(zhì)為：堿解氮含量（w，下同）135.8 mg·kg-1、速效磷含量 169.15 mg·kg-1、速效鉀 91.11 mg·kg-1、有機(jī)質(zhì)1.39%、pH 5.98。供試西瓜品種為‘紅冠龍’。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

西瓜種植模式為單行單壟，壟長(zhǎng)15 m，寬1.3 m，覆蓋黑色地膜。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每壟為1個(gè)重復(fù)，對(duì)照不種作物，面積3 m×3 m。西瓜采用種子直播，連種3茬。

1.3 土壤取樣

取樣前，控制土壤濕度，在濕度相對(duì)一致時(shí)采樣。在不同生長(zhǎng)期分別采取根際、非根際土樣和對(duì)照土樣于50 mL離心管中，-20℃條件下冷凍保存（表1）。

表1 供試土壤取樣情況

西瓜種植第3茬時(shí)，于成熟期發(fā)枯萎病死株，無(wú)法取樣。最終取得對(duì)照、根際、非根際共33個(gè)土壤樣品。

1.4 土壤微生物總DNA提取與PCR擴(kuò)增

土壤微生物總DNA提取方法采用改良CTAB法[10]，以提取的土壤總DNA為模板進(jìn)行ERCI-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。ERCI引物序列按Versalovic J等(1991)報(bào)道的進(jìn)行設(shè)計(jì)，即為 ERIC1R：5'-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3'；ERIC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'；20 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.0 μL，Mg2+濃度為 2.0 mmol·L-1，dNTPs 濃度為 200 μmol·L-1，2.0 UTaqDNA 聚合酶，30 ng 模板 DNA，正反引物濃度為 0.4 μmol·L-1，剩余體積用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性 94℃ 4 min；變性 94℃ 30 s，退火47℃ 50 s，延伸 72℃ 120 s，35循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。反應(yīng)重復(fù)1次。

8.0 %聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)：50 bp與 100 bp DNA Ladder，緩沖液 0.5×TBE，電壓 80～100 V，相機(jī)拍照并記錄結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1 ERCI-PCR數(shù)據(jù)分析 用Shannon-Weaver指數(shù)和其均勻度指數(shù)來(lái)表示群落DNA序列多樣性，通過(guò)ERIC-PCR電泳圖，按吳宇佳等[10]的 RAPD-PCR產(chǎn)物分析方法，計(jì)算 33個(gè)土樣細(xì)菌的ERIC-PCR產(chǎn)物、Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)，分析待測(cè)土樣的細(xì)菌多樣性變化。

Shaanon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)計(jì)算：

Dsh=-∑PilnPi=-∑(Ni/N)ln(Ni/N)，

Jsh=Dsh/lnS。

式中，Dsh表示Shannon-Weaver指數(shù)，Jsh表示均勻度指數(shù)，Pi表示第i個(gè)RAPD條帶出現(xiàn)的概率，Ni表示第i個(gè)RAPD條帶的擴(kuò)增量，N表示土壤微生物群落DNA的RAPD條帶的擴(kuò)增總量（N=∑Ni），S則表示群落DNA序列的豐富度指數(shù)。Dsh最小值0，最大值lnS。

采用DPS 6.0計(jì)算得Shannon-Weaver指數(shù)及均勻度指數(shù)。

1.5.2 土壤細(xì)菌指標(biāo)分析 不同茬數(shù)不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤細(xì)菌多樣性指標(biāo)間的差異比較、環(huán)境溫度與土壤細(xì)菌多樣性指標(biāo)的相關(guān)性分析均用JPM 6.0統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茬數(shù)、同一茬數(shù)不同生長(zhǎng)時(shí)期的非根際土壤細(xì)菌多樣性變化

由圖版A（見彩色插頁(yè)第10頁(yè)）與表2可知，不同生長(zhǎng)期非根際土壤微生物細(xì)菌多樣性的差異顯著，豐富度從 7～16，變異系數(shù)為 26.35%，Dsh在2.662 0～3.991 5之間，變異系數(shù)為12.30%；但不同生長(zhǎng)期非根際土壤細(xì)菌的均勻度變化不大，變異系數(shù)僅為1.90%。其中，第1茬收獲期非根際土壤細(xì)菌生物多樣性最高，豐富度和Dsh分別為16和3.991 5；第1茬初果期最低，豐富度和Dsh分別為7和2.662 0，均勻度在此期也達(dá)到最小值。在3個(gè)茬口中，第1個(gè)茬口的平均Dsh為3.20，第 2個(gè)茬口的平均Dsh為14.27，第3個(gè)茬口的非根際土壤細(xì)菌多樣性隨之下降，平均Dsh為3.57。

為了驗(yàn)證取樣溫度對(duì)非根際土壤細(xì)菌多樣性的影響，對(duì)取樣溫度與Dsh、Jsh和豐富度進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，取樣溫度與Dsh、Jsh呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為：-0.587 6和-0.300 3，但負(fù)相關(guān)性不顯著，即p＞0.05；取樣溫度與豐富度呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.604 1，且p＜0.05，負(fù)相關(guān)性顯著?？梢姡訙囟葘?duì)非根際土壤細(xì)菌多樣性有較大的影響。

2.2 不同茬數(shù)、同一茬數(shù)不同生長(zhǎng)期的根際細(xì)菌多樣性變化

由圖版B（見彩色插頁(yè)第10頁(yè)）、表2可知，西瓜連作后，西瓜根際土壤細(xì)菌多樣性發(fā)生了顯著變化，種群豐富度在7～16之間，變異系數(shù)達(dá)到30.31%；Dsh在2.678 6～3.960 0之間，變異系數(shù)為12.92%，但種群的均勻度變化不大。其中，第1茬伸蔓期和初果期的Dsh均較小，分別為2.678 6和2.680 3，均勻度在這2個(gè)時(shí)期也達(dá)到最小值。第1茬收獲期的根際細(xì)菌多樣性最為豐富，Dsh=3.960 0。

表2 西瓜連作對(duì)土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

進(jìn)一步的分析結(jié)果表明，取樣溫度與豐富度、Dsh、Jsh 呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為：-0.644 3、-0.389 1和-0.613 2，其中，負(fù)相關(guān)顯著的是Dsh和豐富度，p＜0.05。即取樣溫度對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性有較大的影響。

2.3 連作對(duì)同一茬數(shù)同一時(shí)期不同土樣影響的比較

對(duì)比分析結(jié)果表明，雖然取樣溫度對(duì)土壤細(xì)菌多樣性變化有較大影響，但從整體上看，所有樣品的根際土壤細(xì)菌Dsh（12.92%）和豐富度（30.31%）的變異系數(shù)均比對(duì)照土壤的高，非根際土壤的次之。此外，從表2和圖版C（見彩色插頁(yè)第10頁(yè)）中也可以看出，無(wú)論取樣溫度變化多大，每一生長(zhǎng)時(shí)期的樣品中，根際土壤細(xì)菌多樣性均是最小的。可見，西瓜連作后，對(duì)細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響大。

進(jìn)一步分析表明，連作西瓜根際土壤在不同茬口不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)菌多樣性差異較大，其中第2茬伸蔓期和第3茬初果期根際土壤細(xì)菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達(dá)到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16），第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）對(duì)根際土壤細(xì)菌的多樣性影響也較大。但在第1茬初果期和收獲期對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響基本沒有，CV僅分別為1.16%和1.71%，這可能是由于低溫所致，這2個(gè)時(shí)期取樣溫度分別為18.5℃和16.5℃。

3 討論

3.1 應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)分析土壤微生物多樣性

分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方面。這些方法主要有：DGGE（變性梯度膠電泳技術(shù)）、TGGE（溫度梯度凝膠電泳）、ARDRA（16S rDNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析）、T-RFLPs（16S rDNA末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析）、SSCP（單鏈構(gòu)象多態(tài)性）、和ERIC-PCR（腸桿菌基因間的重復(fù)共有序列擴(kuò)增圖譜分析）等方法。通過(guò)這些分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，土壤管理者可根據(jù)實(shí)際情況，快速、準(zhǔn)確、全面且有針對(duì)性地調(diào)理土壤微生物數(shù)目與種類，制定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)措施與耕作制度。

ERIC-PCR用于研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的結(jié)構(gòu)，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離成微生物群落特有的條帶。條帶的數(shù)量、位置及亮度能反映出微生物群落結(jié)構(gòu)的特征。ERIC-PCR技術(shù)重復(fù)性好、靈敏度高，可高效地動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[11]。1999年，科學(xué)家首次在混合菌群群落結(jié)構(gòu)的分析上應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)，得到的指紋圖譜能反映菌群組成差異且重復(fù)性、穩(wěn)定性好。之后，ERIC-PCR逐漸用于微生物群落的結(jié)構(gòu)分析。在本研究中，ERIC分析亦較好地揭示了西瓜連作對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響。應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有操作簡(jiǎn)單、硬件要求低等特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

3.2 連作作物的土壤細(xì)菌多樣性

土壤微生物對(duì)植物土傳病害的抑制作用是在土壤微生物群體影響下完成的，并不是單一菌群作用的結(jié)果[12-13]。土壤中細(xì)菌數(shù)量是衡量土壤中微生物區(qū)系狀況的一個(gè)重要指標(biāo)之一。相關(guān)研究表明，連作后土壤中細(xì)菌數(shù)量會(huì)下降，導(dǎo)致土壤類型由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變[14-16]。而另外一些研究顯示，部分作物連作后土壤細(xì)菌數(shù)量上升[17-18]。趙萌等[19]分析了西瓜連作對(duì)土壤主要微生物類群的影響，結(jié)果顯示，隨著連作茬數(shù)的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量和放線菌數(shù)量先升后降，真菌數(shù)量則相反。因此，開展連作作物土壤多樣性研究非常重要。在本研究中，雖然取樣溫度對(duì)土壤細(xì)菌多樣性變化有影響，但從整體上看，不管哪個(gè)時(shí)期，同一生長(zhǎng)時(shí)期的根際土壤細(xì)菌多樣性均比非根際土壤和對(duì)照土樣的低。西瓜連作對(duì)不同茬口不同生長(zhǎng)期根際土壤細(xì)菌多樣性的影響差異較大，ERIC分析結(jié)果表明，第2茬伸蔓期和第3茬初果期根際土壤細(xì)菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達(dá)到10.7%和10.91%。第1茬伸蔓期（7.48%）到初果期（8.16%）、第 3茬幼苗期（7.00%）到伸蔓期（6.06%）對(duì)根際土壤的細(xì)菌多樣性影響也較大。對(duì)于連作西瓜土壤微生物中各類細(xì)菌數(shù)量的具體分析仍需深入探討。

4 結(jié)論

（1）ERIC-PCR技術(shù)可用于連作西瓜土壤微生物多樣性方面的研究。（2）不同生長(zhǎng)期，連作西瓜的根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性均有較大變化，Shannon-Weaver指數(shù)和豐富度指數(shù)的變異系數(shù)均在12%以上。（3）取樣溫度與連作西瓜根際、非根際細(xì)菌Shannon-Weaver指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其中與豐富度指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.60以上。（4）根際細(xì)菌多樣性影響在不同生長(zhǎng)期是不一樣的，第3茬初果期影響最大，第2茬伸蔓期次之。第3茬初果期和第2茬伸蔓期根際土壤細(xì)菌的Dsh影響最大，變異系數(shù)分別達(dá)到10.91%和10.7%。