□ 張宏博 王洋 王燕 王巖 靳志敏 范鑫 鄭玉山（通訊作者） 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

1 引言

抗生素類(lèi)獸藥長(zhǎng)期無(wú)節(jié)制的使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物免疫力下降，同時(shí)降低了疫苗的作用，進(jìn)而使細(xì)菌疾病成為家禽的重點(diǎn)傳染疾病[1]。喹諾酮是一類(lèi)人畜通用藥，因其具有組織濃度高、藥物保留性好、抵抗多種細(xì)菌、殺菌作用強(qiáng)、抗菌時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)和畜禽等疾病的治療[7]。盡管喹諾酮藥物有諸多優(yōu)良品質(zhì)，但仍需重視其毒副作用，如造成肝損害、引發(fā)周?chē)窠?jīng)病變時(shí)間加快，甚至可能產(chǎn)生不可逆的轉(zhuǎn)變—導(dǎo)致肌無(wú)力癥狀的患者病情加重等[8]。

喹諾酮是羊肉檢測(cè)中最為常見(jiàn)的一種獸藥殘留，其嚴(yán)重影響羊肉制品的安全及羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

展，也已成為我國(guó)羊肉食品出口的主要制約因素。因此，檢測(cè)羊肉中喹諾酮的殘留對(duì)于食品安全管控有重大意義。

2 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)參照GB/T 21312-2007農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告，利用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測(cè)羊肉中培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星6種喹諾酮的殘留量。

2.1 設(shè)備

實(shí)驗(yàn)設(shè)備如表1所示。

2.2 試劑

除特別標(biāo)注外，此次實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑全部都為色譜純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水，實(shí)驗(yàn)試劑如表2所示。

2.3 喹諾酮類(lèi)藥物的檢測(cè)方法

2.3.1 提取

稱(chēng)取5g試樣（精確至0.01g），裝于50mL具螺旋蓋聚四氟乙烯離心管中，之后加入10mL甲酸-乙腈（2∶98）溶液，立即蓋蓋劇烈振搖，旋渦震蕩1分鐘，超聲提取10分鐘，4000r/min離心5分鐘，然后將乙腈層移入另一干凈的聚四氟乙烯離心管中。向離心后的沉淀物中再加入10mL甲酸-乙腈（2∶98）溶液搖勻，旋渦震蕩1分鐘，4000r/min離心5分鐘，合并乙腈提取液，待凈化。

表3 梯度洗脫

表4 MRM離子選擇通道m(xù)/z

2.3.2 凈化

向提取液中加入15mL乙腈飽和正己烷溶液，漩渦震蕩2分鐘，4000r/min離心5分鐘，除去上層正己烷，氮吹至干。準(zhǔn)確加入1mL初始比例流動(dòng)相溶液，超聲1分鐘，旋渦震蕩1分鐘溶解殘?jiān)?，將溶液過(guò)0.22μm微孔濾膜，供高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定。

2.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定

液相色譜條件：色譜柱固定相類(lèi)型為C18、色譜柱型號(hào)為ZORBAX Eclipse Plus C18；規(guī)格：2.1×100mm×1.8μm；柱溫：40℃；室溫：22℃；流動(dòng)相組成：A為0.05%甲酸/水、B為乙腈；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：3μL。

最優(yōu)質(zhì)譜條件：離子源（電噴霧正離子源）；檢測(cè)方式：多反映監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：4 00 0V；離子源溫度：350℃，匯總得出結(jié)果如表4。

3. 結(jié)果與分析

3.1 喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在 濃 度 為 5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/m L、80.0ng/m L、100.0n g/m L得到的線性方程，洛 美 沙 星：Y=52.868650X+16.294 115； 恩諾 沙 星：Y=77.573131X+39.593310； 諾 氟沙 星：Y=35.557671X-0.922820； 環(huán) 丙 沙星：Y=26.118163X+19.661136；氧氟沙星：Y=8 9.4 3 5 71 7 X+1 7.01 1 2 8 9； 培 氟 沙 星：Y=4 1.0 9 7 36 0 X+1 3 0.3 8 7 5 4 6。相關(guān)系數(shù)R2均為0.9 9，峰面積與被測(cè)物質(zhì)濃度呈現(xiàn)出的線性關(guān)系良好。

表5 諾酮類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

3.2 試劑空白

樣品空白如表6所示，在3.0 21～3.2 01m i n之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以諾氟沙星未檢出；在3.1 8 1～3.62 1 m in之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以氧氟沙星未檢出；在2.9 0 1～3.3 4 1 mi n之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以培氟沙星未檢出；在3.1 4 1～3.321m in之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以環(huán)丙沙星未檢出；在2.6 5 1～2.52 1 m in之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以洛美沙星未檢出；在3.16 1～3.6 0 2 mi n之間沒(méi)有出現(xiàn)峰，所以恩諾沙星未檢出。

如表7所示，本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法為，建立6個(gè)加入濃度為100ng/mL混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL的空白試驗(yàn)與空白試劑對(duì)照，將檢測(cè)到的各個(gè)噪音參數(shù)的結(jié)果記下來(lái)，當(dāng)S/N=3時(shí)得到的最低濃度結(jié)果為檢出限。

3.4 回收率

如表8所示，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中所有加入的物質(zhì)都會(huì)有一定損失，故可能導(dǎo)致最終結(jié)果有所誤差。為防止這一現(xiàn)象的發(fā)生，在羊肉中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣液，經(jīng)過(guò)渦旋震蕩后按實(shí)驗(yàn)步驟作其檢測(cè)值與羊肉樣品檢測(cè)值比較計(jì)算，從而知曉試劑是否有配對(duì)，羊肉樣品的檢測(cè)結(jié)果是否無(wú)誤。

表7 氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星的信噪比和檢出限

表8 氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星的回收率

表9 氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星的精密度

3.5 精密度

精密稱(chēng)取6個(gè)空白樣品，加入 1μg/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液4 0μ L，按樣品處理同法操作。經(jīng)計(jì)算得出，氧氟沙星精密度為7.4%、諾氟沙星精密度為6.8%、恩諾沙星精密度為6.9%、環(huán)丙沙星精密度為1 0.5%、培氟沙星精密度為8.5%、洛美沙星精密度為7.2%。

3.6 樣品檢測(cè)

本次試驗(yàn)共檢測(cè)蘇尼特羊、呼倫貝爾羊、大尾羊、山羊、綿羊、小尾寒羊、羊肝、羊毛肚、羊前腿、羊后腿、羊蹄筋、羊心1 2種羊肉樣品，每種樣品檢測(cè)2個(gè)，以減小隨機(jī)誤差，提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)的要求，氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星均不得檢出，環(huán)丙沙星和恩諾沙星之和小于等于 1 0 0 μg/kg才為合格品，反之則為喹諾酮類(lèi)藥物殘留，不合格。

檢測(cè)結(jié)果如表1 0所示，1 2種羊肉樣品中均未檢測(cè)出6種喹諾酮藥物，所取羊肉樣品均符合農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，為合格品，消費(fèi)者可放心購(gòu)買(mǎi)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星試劑空白值全部為0，檢出限分別為 0.06μg/kg、0.02μg/kg、0.07μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.05μg/kg，回收率為84.1%～102.1%，各物質(zhì)的精密度依次是10.5%、7.4%、8.5%、6.8%、6.9%、7.2%。實(shí)驗(yàn)中所用蘇尼特羊、呼倫貝爾羊、大尾羊、山羊、綿羊、小尾寒羊、羊肝、羊毛肚、羊前腿、羊后腿、羊蹄筋、羊心12種羊肉樣品均未檢出6種喹諾酮類(lèi)藥物，本次實(shí)驗(yàn)所采羊肉樣品符合農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，均為合格品。