朱 凱，戰(zhàn) 昊，代 智，周 儉

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所，教育部癌變與侵襲原理重點實驗室，上海 200032

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC, 以下簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有60萬人死于肝癌，其侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因[1-4]。因此，探索肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的分子機制，尋求有效的預(yù)防措施，對改善肝癌患者的預(yù)后及延長患者的生存時間具有重要意義。

本課題組的前期研究[5]提示，異黏蛋白(metadherin，MTDH)能通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增強肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，高M(jìn)TDH表達(dá)是肝癌患者的不良預(yù)后因素，且MTDH是較好的獨立預(yù)后指標(biāo)。通過免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)結(jié)合質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，MTDH能與蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)形成蛋白復(fù)合體。

PRMT5能將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至組蛋白上的精氨酸，從而參與多種細(xì)胞活動[6-9]。越來越多的研究[10-13]顯示，PRMT5與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密。本研究進(jìn)一步探討PRMT5在肝癌組織中的表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年1月至2004年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科就診的323例接受腫瘤切除手術(shù)的肝癌患者的腫瘤及正常肝臟組織的組織芯片?；颊咝g(shù)前均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肝功能分級均為Child-Pugh A級，其中278例(86.1%)感染了乙肝病毒(表1)。323例患者術(shù)后中位隨訪時間為66(2.3～74.0)個月。

1.2 免疫組化染色 腫瘤及正常肝臟組織切片經(jīng)脫蠟、水化、封閉、浸洗等處理后，加入一抗孵育過夜，加入二抗和DAB顯色液，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水后封片，拍照觀察。

MTDH抗體(ab45338)由Abcam公司提供。結(jié)果判定[14]：染色強度以中位光密度(median integrated optical density, mIOD)為分界點分為高表達(dá)組和低表達(dá)組： 高表達(dá)組IOD>mIOD，低表達(dá)組IOD≤mIOD。

PRMT5抗體(#2252)由CST公司提供。對組織中核內(nèi)和核外的染色強度分別評分[15]：采用SPSS軟件計算出IOD的四分位值，將其染色強度由低到高分為-、+、、，并計算各種染色強度所占比例；核內(nèi)或核外表達(dá)評分由“強度×比例”計算得來。如果核內(nèi)表達(dá)評分較高，則判定為核內(nèi)表達(dá)占優(yōu)勢；反之亦然。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。MTDH和PRMT5表達(dá)情況與其他臨床病理特征之間關(guān)系采用Pearson卡方檢驗；采用Kaplan-Meier法分析患者的生存情況，并對其進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PRMT5表達(dá)與肝癌患者臨床病理指標(biāo)及MTDH表達(dá)之間的關(guān)系 PRMT5高表達(dá)者占53.3% (172/323)。Pearson卡方檢驗(表1)提示：PRMT5過表達(dá)與年齡、性別、肝硬化、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及MTDH表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。

表1 肝癌組織PRMT5表達(dá)與患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性 n

續(xù)表1 n

PRMT5在細(xì)胞核內(nèi)外均有分布，其中PRMT5核內(nèi)表達(dá)占優(yōu)勢者(PRMT5核內(nèi)組)為36.8% (119/323)?？ǚ綑z驗(表1)提示：PRMT5核表達(dá)模式與年齡、AFP水平、微血管侵犯、腫瘤分化程度及MTDH表達(dá)密切相關(guān)(P<0.05)。

免疫組化染色(圖1)顯示：PRMT5在細(xì)胞內(nèi)分布與MTDH存在對應(yīng)關(guān)系。在正常肝臟組織中，MTDH及PRMT5表達(dá)均較低；在肝癌組織中，MTDH及PRMT5表達(dá)均升高，且有向核外分布的趨勢。

2.2 PRMT5表達(dá)對患者預(yù)后的評估價值

2.2.1 PRMT5表達(dá)量及分布對預(yù)后的影響 結(jié)果(圖2A～2D)表明：PRMT5高表達(dá)組和PRMT5低表達(dá)組患者術(shù)后1、3、5年總生存率(84.3%vs87.5%，58.6%vs66.2%, 49.9%vs53.6%)及復(fù)發(fā)率(25.2%vs25.3%, 49.6%vs50.8%, 59.3%vs58.6%)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。PRMT5核內(nèi)組患者術(shù)后3、5年總生存率(70.2%vs58.6%, 61.3%vs46.4%)明顯高于PRMT5核外組，復(fù)發(fā)率則明顯低于PRMT5核外組(23.3%vs27.4%, 43.3%vs54.2%, 50.5%vs64.6%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2 MTDH表達(dá)量聯(lián)合PRMT5分布對預(yù)后的影響 結(jié)果(圖2E～2H)表明：MTDH高表達(dá)PRMT5核外組患者術(shù)后1、3、5年總生存率明顯低于MTDH低表達(dá)PRMT5核內(nèi)組(74.0%vs93.7%，39.0%vs80.5%，29.4%vs71.9%)，復(fù)發(fā)率則明顯高于MTDH低表達(dá)PRMT5核內(nèi)組(43.3%vs13.0%，67.3%vs36.1%，77.2%vs42.9%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 HCC及癌旁組織MTDH、PRMT5蛋白的表達(dá)

A：在正常肝臟組織中，MTDH與PRMT5表達(dá)均較低；B：肝癌標(biāo)本1，MTDH表達(dá)量中等、PRMT5表達(dá)量高，PRMT5主要分布于細(xì)胞核；C：肝癌標(biāo)本2，MTDH、PRMT5表達(dá)量高，PRMT5主要分布于核外.Original magnification: ×40(原圖)，×200(放大)

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析PRMT5和(或)MTDH表達(dá)對肝癌預(yù)后的預(yù)測價值

PRMT5表達(dá)對患者的總生存率(A)及復(fù)發(fā)率(B)無顯著影響；PRMT5核內(nèi)表達(dá)占優(yōu)勢的患者總生存率(C)更高，復(fù)發(fā)率(D)更低；MTDH表達(dá)升高的患者總生存率(E)更低，復(fù)發(fā)率(F)更高；MTDH高表達(dá)PRMT5核外組患者生存率明顯低于MTDH低表達(dá)PRMT5核內(nèi)組(G)，復(fù)發(fā)率明顯高于MTDH低表達(dá)PRMT5核內(nèi)組(H)

2.3 患者預(yù)后的影響因素分析 單因素和多因素分析結(jié)果(表2、表3)表明：PRMT5分布(P<0.05)與MTDH表達(dá)(P<0.01)是影響肝癌患者術(shù)后生存率與復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素，且兩者聯(lián)合應(yīng)用的預(yù)測價值更大(P<0.001)。

表2 患者術(shù)后總生存期和疾病復(fù)發(fā)的單因素回歸分析

表3 患者術(shù)后總生存期和疾病復(fù)發(fā)的多因素回歸分析(Cox模型)

*將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素分析

3 討 論

PRMT5對細(xì)胞功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[7-9]。Powers等[7]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中PRMT5高表達(dá)提示預(yù)后不良。Chen等[16]證明，PRMT5通過TGFβ-PRMT5-MEP50通路調(diào)節(jié)乳腺癌和肺癌細(xì)胞的EMT。近期研究[9, 17]顯示，PRMT5在白血病及淋巴瘤中發(fā)揮重要作用。

本研究中，53.3%患者的肝癌組織表達(dá)PRMT5高于對應(yīng)的正常肝臟組織，但表達(dá)高、低組患者預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PRMT5表達(dá)核內(nèi)組患者生存率與復(fù)發(fā)率高于PRMT5表達(dá)核外組(P<0.05)。本研究中，MTDH表達(dá)低，PRMT5主要分布于細(xì)胞核；隨著MTDH表達(dá)升高，PRMT5表達(dá)明顯升高，且有向核外分布的趨勢；MTDH表達(dá)和PRMT5分布均是肝癌的獨立預(yù)后因素，且兩者聯(lián)合應(yīng)用的的預(yù)測價值更高(P<0.001)。

PRMT的主要功能為通過甲基化組蛋白H3、H4的精氨酸，改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和RNA合成等[9, 18-19]。其在惡性腫瘤中發(fā)揮作用的機制還未完全清楚。近期有研究[20]顯示，PRMT5能與Ajuba以及Snail形成蛋白復(fù)合體，從而抑制EMT關(guān)鍵分子E-cadherin的表達(dá)。本課題組前期研究[21]也提示，MTDH高表達(dá)能促進(jìn)β-catenin由胞質(zhì)向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。PRMT5可能通過上述機制促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而在MTDH介導(dǎo)的肝癌EMT中發(fā)揮作用。后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步探討MTDH、PRMT5與E-cadherin以及β-catenin之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究顯示PRMT5在肝癌細(xì)胞中的分布與肝癌的侵襲和預(yù)后密切相關(guān)，PRMT5在肝癌細(xì)胞中的分布和(或)MTDH表達(dá)水平可作為肝癌預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)。