萬(wàn)秀娟　胡京昂　李自娟　應(yīng)芳卿　黃文

摘 要： 為了探究河南省番茄主產(chǎn)區(qū)是否受到煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒、番茄褪綠病毒和番茄侵染型褪綠病毒的復(fù)合侵染，采集葉片邊緣卷曲、葉片皺縮、葉脈間黃化褪綠、植株矮化的疑似煙粉虱傳播的3種病毒病的番茄植株樣品，分別用TYLCV、ToCV和TICV特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，TYLCV和ToCV的特異性引物分別擴(kuò)增得到約780 bp和 460 bp左右的特異性條帶，該條帶與TYLCV和ToCV陽(yáng)性對(duì)照大小一致，且與這2種病毒鄭州分離物核苷酸序列同源性均在99%以上；TICV特異性引物未擴(kuò)增出目的條帶。說(shuō)明河南主栽區(qū)番茄受到煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒的復(fù)合侵染。

關(guān)鍵詞： 番茄；煙粉虱；病毒病；分子鑒定

Molecular identification of whitefly transmitted tomato viruses in Henan

WAN Xiujuan， HU Jingang， LI Zijuan， YING Fangqing， HUANG Wen

（Zhengzhou Vegetable Research Institute，Zhengzhou 450015， Henan， China）

Abstract： In order to explore the viruses which transmitted by whitefly， Tomato chlorosis virus （ToCV）， Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） and Tomato infectious chlorosis virus （TICV） were studied in this paper. The samples which showed symptoms of marginal curling， leaf shrinkage， interveinal chlorosis and dwarf plant were collected in the main tomato areas of Henan Province. Using specific primers of ToCV， TYLCV and TICV， ToCV， TYLCV and TICV were detected by RT-PCR and PCR. The result showed that， the specific primers of TYLCV and ToCV amplified a 780 bp specific band and a 460 bp specific band separately. The two specific bands were amplified with the same size as the positive control by the two sets of specific primers ， and the nucleotide sequence homology between these two viruses and Zhengzhou isolates was above 99%. But no bands of TICV were amplified by RT-PCR by the set of specific primers. Tomato plants were infected by both ToCV and TYLCV in the main planting areas of Henan.

Key words： Tomato； Whitefly； Virus disease； Molecular identification

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全國(guó)各地都有種植，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，種植面積逐漸增大。據(jù)報(bào)道，番茄每年春季因病毒病減產(chǎn)30%以上，夏、秋季損失更為嚴(yán)重，有的年份或地塊幾乎絕收[1-2]。近幾年，由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus disease， TYLCVD）和番茄褪綠病毒?。═omato chlorosis virus disease， ToCVD）嚴(yán)重危害番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。

煙粉虱傳播的病毒病主要有番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus， TYLCV）、番茄褪綠病毒?。═omato chlorosis virus， ToCV）和番茄侵染性褪綠病毒病（Tomato infectious chlorosis virus， TICV）。TYLCV屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。該病毒最早于1939年在以色列約旦河一帶被發(fā)現(xiàn)，1964年被正式命名，主要通過(guò)煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播，也可通過(guò)嫁接傳播，但不經(jīng)機(jī)械摩擦和種子傳毒，寄主主要有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆和煙草等[4]。番茄被TYLCV侵染后，植株生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，頂部葉片皺縮發(fā)黃，葉邊緣上卷。番茄植株早期感染該病毒會(huì)影響正常開(kāi)花結(jié)果；后期感染則導(dǎo)致結(jié)果少且果實(shí)小，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，番茄黃化曲葉病毒病給世界許多地區(qū)的番茄生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性災(zāi)害[5-9]。ToCV和TICV屬于長(zhǎng)線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）。1998年在美國(guó)佛羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)了番茄褪綠病毒，隨后意大利、巴西、以色列、中國(guó)等地也有相繼報(bào)道[10-14]。番茄被ToCV侵染后，葉片褪綠、黃化，尤以植株下部葉片葉脈濃綠，脈間褪綠、黃化最為明顯，貌似缺素癥。在自然條件下，ToCV主要通過(guò)煙粉虱傳播，侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍(lán)雪科等植物，不能通過(guò)摩擦接種的方式侵染植物[15]。近年來(lái)，由于全球氣候變暖及保護(hù)地蔬菜面積增加，煙粉虱在全世界擴(kuò)散與爆發(fā)，由煙粉虱傳播的番茄病毒病給番茄生產(chǎn)造成了巨大損失。目前，防治由煙粉虱傳播的番茄病毒病最有效的方法是種植抗病品種。

筆者主要通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，利用TYLCV、ToCV和TICV的特異性引物，對(duì)河南省番茄主栽區(qū)的疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，并建立一套快速的煙粉虱傳播的番茄病毒病檢測(cè)體系，為番茄病毒病的綜合防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測(cè)番茄樣品 2016年9月在鄭州、中牟、新鄭和濟(jì)源的番茄大棚中采集葉脈褪綠，葉片邊緣卷曲、皺縮、褪綠黃化的番茄葉片，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 生化試劑 RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；RTase M-MLV（RNase H-）和RNase Inhibitor購(gòu)自Promega公司；Taq DNA聚合酶、凝膠回收純化試劑盒和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自杭州博日科技有限公司；dNTPs和T4 DNA Ligase 購(gòu)自TaKaRa公司；其他生化試劑和化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 菌株、陽(yáng)性對(duì)照和克隆載體 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株與TYLCV、ToCV陽(yáng)性對(duì)照由鄭州市蔬菜生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD18-T 購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA提取及RT-PCR 稱取番茄葉片約0.1 g加入液氮研磨成粉末，按照TRIzol法提取植物總RNA，用于cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：總RNA 5.0 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ToCV和TICV下游引物ToC-6、TICVR 1.0 μL（10 μmol·L-1），RNase-Free H2O 3 μL，70 ℃變性10 min，立即冰上放置2 min，再加入5×M-MLV Buffer 5 μL，200 U·μL-1 RTase M-MLV（RNase H-）1.0 μL，40 U·μL-1 RNase Inhibitor 0.5 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL，37 ℃水浴60 min。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：cDNA 5.0 μL，Taq酶 1 μL（5 U·μL-1），ToC-5/ToC-6引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 13.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[16]。根據(jù)Panno S等[17]報(bào)道，番茄侵染性褪綠病毒的檢測(cè)應(yīng)用TICVF/TICVR特異性引物，PCR反應(yīng)體系同ToCV，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[2，17]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照，并經(jīng)膠回收試劑盒純化后，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 植物總DNA提取及TYLCV檢測(cè) 稱取0.1 g番茄葉片樣品，加入液氮充分研磨成粉末，參照 CTAB法[18]提取番茄葉片總DNA，用于后續(xù)試驗(yàn)。番茄黃化曲葉病毒檢測(cè)采用TYLCV特異性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：模板DNA 1.0 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U·μL-1），TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 19 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[4]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照，并經(jīng)膠回收試劑盒純化后，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序。各引物序列詳見(jiàn)表1。

1.2.3 雙重PCR檢測(cè)ToCV和TYLCV 以ToC6反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和提取的葉片DNA為模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，dNTPs 1.0 μL（2.5 mmol·L-1），ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），Taq酶1.0 μL（5 U·μL-1），cDNA模板1.0 μL DNA 5.0 μL，加ddH20至體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，53 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[19]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照。

1.2.4 序列比對(duì)分析 利用NCBI序列比對(duì)工具BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析克隆獲得4個(gè)樣品的ToCV HSP70h部分序列和TYLCV CP的序列，根據(jù)相似性確定病毒種類(lèi)，并與國(guó)際上報(bào)道的ToCV HSP70h與鄭州分離物（KR 150985）和TYLCV鄭州分離物（JQ 034622）進(jìn)行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄疑似病株的田間表現(xiàn)

疑似復(fù)合感染ToCV和TYLCV的番茄植株，在抗TYLCV品種上表現(xiàn)為葉片沿葉脈褪綠變黃，葉片變脆，有壞死斑點(diǎn)等典型的ToCV癥狀；在感TYLCV品種上表現(xiàn)葉片邊緣黃化、皺縮、葉片增厚和植株矮化等典型的TYLCV癥狀。

2.2 番茄疑似病株的分子檢測(cè)

對(duì)在4個(gè)地區(qū)采集的疑似病株樣品分別提取RNA和DNA，采用ToCV和TICV的特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所有樣品中，ToCV特異性引物均擴(kuò)增出460 bp左右的特異性條帶，TICV特異性引物未擴(kuò)增出目的條帶；采用TYLCV的特異性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4個(gè)地區(qū)樣品中均擴(kuò)增到約780 bp左右的條帶（圖1），序列比對(duì)分析表明，4個(gè)地區(qū)樣品ToCV HSP70h和TYLCV外殼蛋白基因核苷酸序列與這2種病毒的鄭州分離物同源性均在99 %以上。結(jié)果表明，4個(gè)地區(qū)的檢測(cè)樣品均被ToCV和TYLCV復(fù)合侵染。

2.3 雙重PCR檢測(cè)ToCV和TYLCV

以ToC6反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和提取的葉片DNA為模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品中均擴(kuò)增得到460 bp和780 bp左右的條帶（圖2），表明采用雙重PCR可以通過(guò)1次PCR反應(yīng)完成對(duì)2種煙粉虱傳播的病毒病的分子檢測(cè)。

3 討論與結(jié)論

煙粉虱是番茄黃化曲葉病毒、番茄褪綠病毒和番茄侵染性褪綠病毒的共同傳播媒介。近年來(lái)，番茄黃化曲葉病毒病已經(jīng)成為河南地區(qū)番茄產(chǎn)區(qū)的普發(fā)病害。目前，種植番茄抗病品種是控制番茄黃化曲葉病毒病最安全、有效的途徑。煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒病、番茄褪綠病毒病以及番茄黃化曲葉病毒病和番茄褪綠病毒病復(fù)合侵染的分子鑒定已有報(bào)道[2-4，14]，筆者為了提高檢測(cè)效率，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，建立了一套檢測(cè)TYLCV、ToCV和TICV 3種病毒復(fù)合侵染的方法。TICV侵染番茄后的癥狀與ToCV相似，筆者運(yùn)用TICV的特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行RT-RCR，所有樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明樣品未受到TICV侵染，用TYLCV和ToCV特異性引物擴(kuò)增，所有樣品均擴(kuò)增出目的條帶，且與這2種病毒鄭州分離物的核苷酸序列同源性均在99 %以上，說(shuō)明樣品均受到TYLCV和ToCV侵染。但是，在實(shí)際生產(chǎn)中種植的抗TYLCV番茄品種是否對(duì)ToCV表現(xiàn)抗病，或者是易被ToCV侵染，還需進(jìn)一步研究。

TYLCV和ToCV在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道發(fā)生以來(lái)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)各個(gè)地區(qū)危害番茄生產(chǎn)的主要病害。筆者利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)河南4個(gè)地區(qū)番茄疑似該2種病毒侵染的葉片樣品進(jìn)行檢測(cè)，均檢測(cè)到TYLCV和ToCV，屬于復(fù)合侵染，這也是在河南首次明確番茄受到番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒的復(fù)合侵染。

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