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        香青蘭總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化及TGF-β1/Smad通路的影響

        2018-11-12 06:58:52信盼王新春黃川生郭新紅袁勇曹文疆
        關(guān)鍵詞:青蘭平滑肌主動脈

        信盼 ,王新春 ,,黃川生 ,郭新紅 ,袁勇 ,曹文疆 *

        (1石河子大學藥學院,新疆 石河子 832002;2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832008)

        動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的重要病理學基礎(chǔ),也是導致心血管疾病患者死亡的重要原因。AS發(fā)病機制相對復雜,其具體致病機理尚不清楚。眾多研究表明,炎性反應(yīng)是AS病理形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2],作為AS的基本特征和始動因子,炎性反應(yīng)可以啟動斑塊內(nèi)炎性細胞分泌多種細胞因子,通過不同途經(jīng)影響斑塊的穩(wěn)定性,從而參與AS的形成與發(fā)展[3]。因此,降低炎性因子的表達是治療AS的一種重要手段。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一種具有多種生物學的功能細胞因子,能夠調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化和遷移,刺激多種細胞因子和炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)的合成和分泌,并參與細胞外基質(zhì)合成與降解。研究表明,TGF-β/Smad信號通路在心腦血管疾病中扮演著重要角色,尤其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。

        香青蘭(Dracocephalum moldovicaL.),為唇形科一年生草本植物[6],是新疆地產(chǎn)植物藥,在臨床主要用于治療心絞痛、高血壓、動脈粥樣硬化及心肌缺血等疾病。香青蘭中主要含有黃酮類、揮發(fā)油、萜類、氨基酸、微量元素及多肽等化學成分,且黃酮類化合物是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),香青蘭總黃酮(Dracocephalum moldavicaL.total flavones,TFDM)可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)和抑制AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞異常增殖和遷移,從而延緩AS的病理進程[9-11]。而對于其抗AS的具體作用機制研究較少。因此,本研究通過高脂飲食誘導載脂蛋白E基因敲除小鼠建立AS模型,在此基礎(chǔ)上探討香青蘭總黃酮干預治療AS的作用及其可能機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠40只及8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠8只,購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0011。實驗操作均符合醫(yī)學倫理學標準。

        1.2 藥物及試劑

        香青蘭總黃酮(新疆自治區(qū)藥物研究所,批號20131109),辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司,批號 M042689),膽固醇(Solarbio,批號 1012E111),小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號AK0017OCT19004),小鼠白介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號AK0017OCT19006),小鼠單核細胞趨化蛋白 1(MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號AK0017OCT19003)及小鼠白介素 6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號AK0017OCT19005)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,RIPA組織細胞裂解液(Solarbio,批號 20150319);5×蛋白上樣緩沖液(Solarbio,批號 P01411/60237),磷酸酶抑制劑混合物(Solarbio,批號 P1260),HRP辣根酶標記山羊抗兔(北京中杉金橋,批號 131879);HRP辣根酶標記山羊抗小鼠(北京中杉金橋,批號131224),TGF-β1小鼠單克隆抗體(abcam,批號GR212859-1),Smad2/3兔單克隆抗體(abcam,批號GR266690-2),p-Smad2/3兔多克隆抗體(abcam,批號GR52460-10),GAPDH多克隆抗體(武漢三鷹,批號10494-1-AP),ECL 超敏發(fā)光試劑盒(Thermo,批號RJ238588)。

        1.3 儀器

        DB-09型石蠟包埋機(湖北德立森科技有限公司),RM2245半自動石蠟切片機(Leica公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學儀器有限公司),Sunrise酶標儀(TECAN公司),EPS300電泳儀(Tanon公司),EC3 600凝膠成像儀(美國UVP公司)。

        1.4 方法

        1.4.1 動物分組

        將40只SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機分為5組,每組8只:即模型組(Model,給予相應(yīng)生理鹽水)、香青蘭總黃酮低劑量組(TFDM-L,21 mg/kg/d)、香青蘭總黃酮中劑量組(TFDM-M,42 mg/kg/d)、香青蘭總黃酮高劑量組(TFDM-H,84 mg/kg/d) 和辛伐他汀組(Simvastatin,3.5 mg/kg/d)。8只相同基因背景和周齡的雄性C57BL/6J健康小鼠作為正常對照組(Normal)。

        1.4.2 模型建立及取材

        正常對照組以普通飼料喂養(yǎng),模型組、辛伐他汀組和TFDM各給藥組以高脂飼料(0.75%膽固醇、15%豬油、84.25%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng),并每日灌胃相應(yīng)劑量的藥物;所有動物自由飲食飲水,飼養(yǎng)環(huán)境維持光照時間 12 h/d,溫度(25±2)℃,濕度 45%~65%。連續(xù)灌胃干預12周。實驗結(jié)束前,各組小鼠禁食不禁水12 h,眼球取血,3000 r/min離心10 min,取血清,-20℃保存待用。分離小鼠主動脈根部1 cm固定于4%多聚甲醛中,其余置于-80℃保存待用。

        1.4.3 病理形態(tài)學檢查

        主動脈固定完全后進行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片,切片厚度為5 μm。行蘇木素-伊紅(HE)染色,切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,酸酒精分化,伊紅染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,最后經(jīng)中性樹脂封片后置于光學顯微鏡下觀察主動脈病理形態(tài)的變化。Image-Pro Plus 6.0測算主動脈斑塊和管腔面積。

        1.4.4 血清 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 水平測定

        檢測各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的水平,具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行。

        1.4.5 主動脈 TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3 蛋白表達的測定

        取小鼠主動脈,用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織蛋白并測定所提蛋白濃度,蛋白樣品經(jīng)上樣緩沖液處理后進行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,再電印跡轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉或BSA室溫封閉2 h,加一抗4℃孵育過夜(GAPDH、TGF-β1、p-Smad2/3和 Smad2/3的稀釋比例分別為 1∶5000、1∶1000、1∶500、1∶1000),洗膜3次,加二抗室溫孵育1h,洗膜3次,最后用ECL試劑盒顯色,凝膠成像儀拍照。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件對條帶進行分析。

        1.5 統(tǒng)計學分析

        采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均以均值±標準差(X±S)表示,多組間比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈病理形態(tài)學變化的影響

        HE染色結(jié)果如圖1所示,正常組小鼠主動脈內(nèi)膜完整,無明顯平滑肌細胞增生,管腔未明顯狹窄,無AS斑塊形成。與正常組相比,模型組主動脈內(nèi)膜平滑肌細胞增生,斑塊面積較大,脂質(zhì)核心大,纖維帽薄,管壁彌漫性增厚并呈現(xiàn)向管腔發(fā)展的占位性病變,導致管腔明顯狹窄。與模型組相比,TFDM各劑量組和辛伐他汀組可見平滑肌細胞增生,斑塊面積較小,脂質(zhì)核心小,纖維帽厚,血管內(nèi)膜局部增厚,管腔狹窄程度較輕,病變較局限。說明TFDM可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成,增強斑塊穩(wěn)定性。

        圖1 小鼠主動脈組織病理學檢查(HE染色×40)Fig.1 Histopathologic examination aorta in mice(HE×40)

        2.2 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的影響

        由表1可知:各組小鼠主動脈管腔面積無顯著性差異(P>0.05)。與模型組相比,TFDM各劑量組及辛伐他汀組斑塊面積與管腔面積比值明顯降低,且具有顯著性差異(P<0.05 或P<0.01),說明 TFDM 可明顯減少動脈粥樣硬化斑塊面積。

        表1 不同實驗組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的比較 X± STab.1 Comparison of aortic atherosclerotic plaque area and lumen area of ApoE-/- mice in different groups X± S

        2.3 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠多種炎癥因子表達的影響

        如圖2所示,與正常組相比,模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 濃度顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,TFDM低、中、高劑量組和辛伐他汀組血清 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1濃度顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

        說明TFDM可抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表達,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性變化。

        圖2 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠多種炎癥因子表達的影響Fig.2 Effects of TFDM on the expression of various inflammatory factors in ApoE-/-mice

        2.4 香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白表達的影響

        如圖3所示,與正常組相比,模型組主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及 Smad2/3的蛋白水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,TFDM 低、中、高劑量組和辛伐他汀組主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3的蛋白水平顯著降低(P<0.01)。

        說明TFFDM可抑制ApoE-/-小鼠主動脈中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表達,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性變化。

        圖3 各組小鼠主動脈TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表達Fig.3 Expression of TGF-β1,p-Smad2/3 and Smad2/3 proteins in the aorta of mice in each group

        3 討論

        AS是一種與眾多心腦血管疾病危險因素相關(guān)的慢性炎癥性疾病,常常累及多個臟器,其病變特征是血管內(nèi)壁有脂質(zhì)斑塊生成,導致管腔內(nèi)變窄和變硬,進而影響組織供血。本研究采用高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠建立AS模型,藥物持續(xù)干預12周,結(jié)果顯示,相比于模型組TFDM各劑量組小鼠主動脈斑塊面積較小,脂質(zhì)核心小,纖維帽厚,血管內(nèi)膜局部增厚,管腔狹窄程度較輕,斑塊面積與管腔面積比值顯著降低。表明TFDM可通過抑制AS斑塊的形成從而延緩AS進程。

        AS發(fā)病機制十分復雜,存在多種學說,炎癥學說是AS發(fā)病機制的主流學說。炎性反應(yīng)貫穿于AS的形成和發(fā)展,通過啟動斑塊內(nèi)炎性細胞分泌多種細胞因子,而影響斑塊的穩(wěn)定性[3]。因此降低炎性因子的表達,抑制炎癥反應(yīng)是防治AS的重要思路與方向。IL-1β是致AS的重要炎性細胞因子,主要由活化的巨噬細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生,相關(guān)研究表明,IL-1β可促進平滑肌細胞增殖和炎癥細胞粘附,誘導基質(zhì)金屬蛋白酶合成,增加血管通透性等[12-14]。IL-6主要由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及內(nèi)分泌組織等釋放,能夠放大急性炎癥反應(yīng)、促使機體產(chǎn)生慢性炎癥,并處于中心地位。在AS進程中,IL-6可通過誘導血小板源性生長因子,促進血管平滑肌細胞增殖,增強局部炎癥反應(yīng)。MCP-1是AS形成和發(fā)展過程中十分重要的趨化因子,隨AS病變程度的加重而升高,是冠心病的獨立危險因素之一[15]。MCP-1可通過介導單核細胞向血管損傷部位不斷聚集,再侵入內(nèi)皮進一步分化為巨噬細胞,從而啟動及促進AS的進程。其對平滑肌細胞也有趨化增殖作用,并可誘導組織因子表達,促進局部血栓形成。因此,阻斷MCP-1作用也是抑制早期血管炎癥反應(yīng)和穩(wěn)定斑塊的重要手段。此外,TNF-α被證實存在于動脈粥樣樣硬化斑塊中,在AS和炎癥中發(fā)揮作用,并且可以加重脂質(zhì)代謝紊亂[16]。TNF-α可刺激自身及IL-1、IL-6、細胞黏附分子的表達,發(fā)揮促炎作用。在AS的進程中,TNF-α通過促進細胞凋亡和平滑肌增殖,激活血小板黏附和聚集功能,從而增加血栓形成的風險[17]。本實驗研究結(jié)果顯示,相比于模型組,TFDM各劑量組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達水平均顯著降低。表明TFDM可能通過抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1的表達,從而抑制平滑肌細胞增殖,減輕局部炎癥反應(yīng),延緩AS病理進程。

        TGF-β作為一種多功能的細胞因子,對AS進程中動脈內(nèi)皮的損傷,血管平滑肌的遷移,動脈壁脂質(zhì)聚集,細胞外基質(zhì)的沉積和炎性細胞的浸潤等關(guān)鍵步驟均有調(diào)節(jié)作用。在TGF-β家族中,TGF-β1功能最多,活性最強,分布最廣,Smad蛋白家族是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導的主要分子,介導信號從細胞膜向細胞核的傳遞[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路參與多種心血管相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展,因此成為臨床及科研領(lǐng)域的研究熱點。據(jù)報道,在生理狀態(tài)下Smad3表達水平較低,TGF-β可抑制血管平滑肌細胞的增生。而在炎癥或者損傷后,Smad3水平上調(diào),TGF-β則促進血管平滑肌細胞增生[19]。從而發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路對血管平滑肌細胞可能具有雙向調(diào)節(jié)作用。本實驗研究結(jié)果顯示,模型組主動脈中TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平顯著高于正常組,而與模型組相比,TFDM各劑量組TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平明顯降低。表明TFDM可能通過抑制TGF-β1及下游蛋白Smad2/3,P-Smad2/3的表達,阻止核轉(zhuǎn)位,從而干預TGF-β1/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導,抑制平滑肌細胞的增生和遷移。

        綜上所述,香青蘭總黃酮可能通過抑制炎癥反應(yīng)和干預TGFβ1/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導,抑制平滑肌細胞的增殖和遷移,減輕炎癥反應(yīng),增加斑塊的穩(wěn)定性,從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。本研究為探究香青蘭總黃酮抗AS作用及其機制提供了新的理論依據(jù)。TGF-β具有多種生物學功能,其網(wǎng)絡(luò)式分子信號通路復雜又龐大,因此,TGFβ/Smad信號在科研及臨床領(lǐng)域仍有著廣泛的研究空間,并在防治心血管疾病方面有著良好的應(yīng)用前景。

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