郭峰，董丹，陳聰哲，楊琨，侯雋，王仙，吳向未，陳雪玲*

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子 832000）

包蟲(chóng)?。╤ydatidosis，hydatid disease）又稱為棘球蚴病，是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granulosus）的原頭節(jié)感染人體及牛、綿羊等家畜所引起。包蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患疾病，主要分布于牧區(qū)和半農(nóng)牧區(qū)，是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)西部各省是該病高發(fā)區(qū)之一[1-2]。根治性手術(shù)仍然是包蟲(chóng)病的主要治療手段，術(shù)前及術(shù)后均需化學(xué)藥物輔助治療。且因手術(shù)并發(fā)癥常見(jiàn)、術(shù)后易復(fù)發(fā)及部分患者無(wú)法接受手術(shù)治療等問(wèn)題，藥物治療是一種較有效治療方式。目前脂溶性苯并咪唑類中的阿苯達(dá)唑（ABZ）為棘球蚴病首選治療藥物之一，經(jīng)長(zhǎng)期藥物治療可顯著延長(zhǎng)術(shù)后病人壽命[3-4]。

阿苯達(dá)唑存在胃腸道吸收差，肝臟血藥濃度低等缺點(diǎn)，使其藥效受到限制。因此，提高阿苯達(dá)唑的臨床療效需增加藥物的溶解度和生物利用率。納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不斷發(fā)展和滲透，納米材料的運(yùn)載體為棘球蚴病的藥物治療開(kāi)辟了新的思路。納米藥物載體將藥物包封于亞微粒中或吸附于亞微粒表面，增加難溶藥物的溶解度和生物利用率[5]、改變藥物體內(nèi)分布、提高藥物安全性和臨床療效[6]。納米藥物載體技術(shù)將促進(jìn)抗寄生蟲(chóng)藥物加速發(fā)展，現(xiàn)研究尚處于初級(jí)階段，具有廣闊的發(fā)展前景[7-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清購(gòu)自 Hyclone公司。DMSO，高效RIPA組織裂解液。NQO-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。藥物由澳大利亞昆士蘭大學(xué)顧文藝教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的采集和培養(yǎng)

從新疆昌吉市屠宰場(chǎng)采集新鮮自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊肝臟，流水清洗干凈肝臟，肝臟及包囊表面經(jīng)75%酒精消毒，抽取無(wú)污染含有原頭節(jié)囊液置于廣口瓶中。靜置5 min原頭節(jié)自然沉淀后棄去多余囊液及較大殘余囊皮，用含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的 PBS漂洗原頭節(jié)至澄清，用 0.1%伊紅染色做染液排斥試驗(yàn)，檢測(cè)活力（活力≥90%）。收集活性良好的原頭節(jié)，加入適量含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待用。

1.2.2 藥物試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為 9組，空白對(duì)照組，3.13、6.25、12.5、25 μg/mL的納米化阿苯達(dá)唑藥物干預(yù)組及相同濃度阿苯達(dá)唑粉劑藥物干預(yù)組。培養(yǎng)3 d后，PBS漂洗細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)3次，每次3 min，各藥物處理組培養(yǎng)板孔內(nèi)分別加入相應(yīng)藥物及培養(yǎng)液，每處理組分別加入約3500個(gè)原頭節(jié)樣本。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每3 d更換1次藥物及培養(yǎng)液。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察原頭節(jié)活力變化

移液器混勻各藥物處理組樣本，“十”字形抽取各處理組100 μL樣本（約含原頭節(jié)100個(gè)），離心后吸出多余培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移原頭節(jié)至載玻片，在倒置顯微鏡下觀察經(jīng)0.1%伊紅染色后原頭節(jié)形態(tài)及活力?；盍α己玫脑^節(jié)拒染且結(jié)構(gòu)較為飽滿正常，死亡或活性較差的的原頭節(jié)被伊紅染液不同程度紅染并可能觀察到伴有結(jié)構(gòu)破壞，計(jì)算各組死亡率，繪制活力曲線圖。

1.2.4 原頭節(jié)抗氧化酶活性檢測(cè)

取取空白對(duì)照組、DMSO對(duì)照組、阿苯達(dá)唑粉劑處理組和納米化阿苯達(dá)唑處理組（3.13、6.25、12.5、25 μg/mL）作用 3、6 d組的原頭節(jié)，用 PBS漂洗 3次，每次3 min，加入RIPA裂解液，裂解原頭節(jié)提取蛋白，4℃12000 g離心，轉(zhuǎn)移上清液至EP管內(nèi)，測(cè)定各處理組蛋白濃度并將各組所提蛋白的濃度配平。按照NQO-1檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)各組原頭節(jié)抗氧化酶活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物作用對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)變化的影響

倒置顯微鏡下觀察空白對(duì)照組原頭節(jié)活動(dòng)正常，伊紅染色拒染不著色，蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)清晰完整。各用藥組原頭節(jié)活動(dòng)減弱至死亡，蟲(chóng)體紅染體積變小，發(fā)生皺縮，蟲(chóng)體外翻型增多，結(jié)構(gòu)破壞。納米化阿苯達(dá)唑組原頭節(jié)的死亡率高于阿苯達(dá)唑粉劑組，且高濃度組形態(tài)改變較低濃度組蟲(chóng)體更明顯。顯微鏡下原頭節(jié)形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的形態(tài) (100×)Fig.1 E.granulosus protoscoleces cultured with nano ABZ observed by inverted microscope(100×)

2.2 藥物作用對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活力的影響

空白對(duì)照組原頭節(jié)活力在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化。各濃度阿苯達(dá)唑粉劑和納米化阿苯達(dá)唑處理組原頭節(jié)活力與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)活力曲線，納米化阿苯達(dá)唑及阿苯達(dá)唑粉劑對(duì)原頭節(jié)活性抑制作用呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性。各用藥組原頭節(jié)培養(yǎng)不同天數(shù)后活力曲線（圖2）。

圖2 不同濃度阿苯達(dá)唑作用后原頭節(jié)的活力值Fig.2 Loss of viability of E.granulosus protoscolices during in vitro ABZ powder and nano ABZ treatment

2.3 阿苯達(dá)唑?qū)?xì)粒棘球蚴原頭節(jié)氧化酶酶活性的影響

不同濃度納米阿苯達(dá)唑處理原頭節(jié)NQO-1酶活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，藥物作用的原頭節(jié)與空白組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 納米阿苯達(dá)唑在作用3d和6d后原頭節(jié)NQO-1酶活性變化Fig.3 Effects of nano ABZ on NQO-1 activity in protoscoleces at 3 days and 6 days

3 討論

細(xì)粒棘球蚴病是由細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，呈全球性分布，牧區(qū)高發(fā)，治療方式主要包括外科手術(shù)切除和化學(xué)藥物治療。目前，手術(shù)仍然是治療棘球蚴病的最主要方式，但由于手術(shù)過(guò)程中原頭節(jié)外溢難以避免、小部分外囊壁易殘留等問(wèn)題，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[10-12]。所以輔以術(shù)前術(shù)后藥物治療，對(duì)細(xì)粒棘球蚴病治療具有重要意義。阿苯達(dá)唑又名丙硫苯咪唑，1975年研制合成，是臨床上常用的治療棘球蚴病的輔助藥物[13]。

本研究觀察了不同濃度納米化阿苯達(dá)唑和普通阿苯達(dá)唑在體外對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的作用。不同劑量組阿苯達(dá)唑在體外均對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活力有抑制作用，細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的活力隨著阿苯達(dá)唑濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴性，其中以25 μg/mL納米化阿苯達(dá)唑組對(duì)原頭節(jié)的殺傷作用更顯著。藥物作用與對(duì)照組的差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了該藥在體外有一定的抗原頭節(jié)作用。

普通阿苯達(dá)唑片劑、粉劑由于不溶于水和大部分有機(jī)溶劑，存在著溶解度低，腸道吸收差，血藥濃度低等缺點(diǎn)[14]，阿苯達(dá)唑溶解性如有輕微的提高對(duì)于它的腸道吸收性以及肝血藥濃度至關(guān)重要[15]。而納米化阿苯達(dá)唑解決了阿苯達(dá)唑的難溶性缺陷，提高了阿苯達(dá)唑的溶解度，因此治療棘球蚴病的效果更具優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了納米化阿苯達(dá)唑?qū)υ^節(jié)抑制作用優(yōu)于阿苯達(dá)唑粉劑，有望成為理想的抗棘球蚴病藥物。

體外試驗(yàn)具有簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短、易觀察等優(yōu)點(diǎn)，是初步觀察抗棘球蚴病新藥物治療效果的有效手段，穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、有效的體外培養(yǎng)方法作為常規(guī)抗棘球蚴病藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)具有重要意義[16-17]。但因阿苯達(dá)唑在體內(nèi)代謝過(guò)程較為復(fù)雜，納米化阿苯達(dá)唑治療效果還需疾病動(dòng)物模型試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。