黃國濤 洪莉 胡鳴 周敏 陳乾

[摘要] 宮頸癌是女性常見惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)紫草素能夠誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，并調(diào)控MAPKs的活性，上調(diào)p53的表達(dá)水平，引發(fā)B淋巴細(xì)胞瘤-2家族蛋白水平的改變，造成線粒體外膜通透性改變，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)一系列caspase的級聯(lián)反應(yīng)，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，也可通過降低人宮頸癌細(xì)胞中FAK的表達(dá)水平和磷酸化水平來抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低其黏附、侵襲和遷移能力，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。本文就其作用機理進(jìn)行詳細(xì)綜述。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；紫草素；機理；綜述

[中圖分類號] R711.74 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0034-04

Research progress on the mechanism of shikonin against cervical cancer

HUANG Guotao HONG Li HU Ming ZHOU Min CHEN Qian

Department of Gynecology and Obstetrics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Cervical cancer is a common malignant tumor in women. Studies have shown that shikonin could induce ROS in human cervical cancer cells， regulate the activity of MAPKs， upregulate the expression of p53， change the protein level of B-cell lymphoma-2 family， trigger a cascade of caspase cascades， perturbate the mitochondrial membrane permeability and release the cyt ochrome-C from the mitochondria to the cytoplasm， which induces apoptosis of cells. In addition， it could also inhibit cell proliferation， promote apoptosis and reduce its biological behavior by decreasing the expression level and phosphorylation level of FAK in human cervical cancer cells. In this paper， a summary review is given about the detailed mechanism.

[Key words] Cervical cancer； Shikonin； Mechanism； Review

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤。在欠發(fā)達(dá)國家或地域，宮頸癌具有較高的發(fā)病率和死亡率，并在女性致命疾病中位列第三[1]。即便手術(shù)和放、化療等綜合應(yīng)用能夠改善早期宮頸癌的預(yù)后情況，但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的宮頸癌卻難以根治，這同樣是造成宮頸癌具有較高死亡率的主要因素之一。紫草素是一類萘醌化合物，是從紫草根部獲取的有效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。本文擬綜述紫草素抗宮頸癌細(xì)胞作用機制方面的研究進(jìn)展。

1 紫草素的生物特性

紫草為紫草族多年生草本植物，具有超過兩千年的藥用記載，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》。紫草素是紫草的有效成分之一，具備抗炎、抗菌、抗腫瘤等效用。紫草素可以對抗由脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)，并上調(diào)IL-10的表達(dá)，且具有一定的濃度依賴性；紫草素能降低由LPS刺激的Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）表達(dá)以及核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的p65亞基磷酸化表達(dá)水平[3]。紫草素的抗炎機制可能是通過TLR4介導(dǎo)的信號通路活化NF-κB，降低TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，并促進(jìn)IL-10的表達(dá)。紫草素具有廣泛的抗菌譜，包括革蘭陰性菌中的沙門氏菌、大腸埃希菌，蠟狀芽孢桿菌、金葡菌在內(nèi)的革蘭陽性菌，以及白色念珠菌。最低抑菌濃度和最低殺菌濃度表明，紫草素對相關(guān)細(xì)菌和真菌的抗菌作用與左氧氟沙星相當(dāng)，其具有抗菌效用可能是由于與抗菌藥物胡桃醌具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]。近年來，隨著對紫草素功能機制的探究，其抗腫瘤活性被人們發(fā)現(xiàn)，并成為關(guān)注的熱點。研究表明，在體內(nèi)或體外實驗中應(yīng)用紫草素處理胃癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞系，抗腫瘤效果良好[5-6]。紫草素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制血管增生等多種方式而達(dá)到抗腫瘤效果。

2 紫草素抗宮頸癌細(xì)胞作用機制

2.1 通過ROS/MAPKs/caspase信號通路

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是需氧細(xì)胞在有氧代謝過程中生成的一類擁有較高氧化活性、化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷暮躅愇镔|(zhì)。細(xì)胞內(nèi)源性ROS大部分在線粒體內(nèi)產(chǎn)生，呼吸鏈電子傳遞過程中會有部分電子漏出直接傳遞給O2而生成ROS。ROS內(nèi)含有未成對電子，具有較高的氧化活性，過度的氧化應(yīng)激會產(chǎn)生大量的ROS，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、核酸、細(xì)胞器膜蛋白等造成損害，引起細(xì)胞內(nèi)正常生理生化功能的紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至死亡[7]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族成員包括4個亞家族：ERKs、JNKs/SAPKs、p38、ERK5/BMK，是一類把細(xì)胞外信號，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素等傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。其介導(dǎo)的信號通路與細(xì)胞的多種生理生化過程密切相關(guān)。P38參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]及炎癥[9]的發(fā)生發(fā)展等過程，可作為抗炎新藥研發(fā)的靶點。JNKs/SAPKs參與調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程[10]，是應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要參與者。ERK介導(dǎo)細(xì)胞的增殖分化[11]，并參與部分生長因子受體和營養(yǎng)相關(guān)受體的活化。caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一組與程序性細(xì)胞死亡（包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和程序性壞死）和炎癥密切相關(guān)的蛋白酶。caspase在程序性細(xì)胞死亡中的作用于1993年首次發(fā)現(xiàn)，并證實其能夠在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase的激活確保細(xì)胞成分以受控的方式降解，對周圍組織進(jìn)行細(xì)胞死亡的影響最小。caspase也在炎癥中起到重要作用，可直接處理促炎細(xì)胞因子，例如pro-IL-1β[12]。這些信號分子可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞募集到受感染的細(xì)胞或組織。研究表明，caspase還與細(xì)胞增殖，腫瘤抑制，細(xì)胞分化，神經(jīng)發(fā)育，軸突誘導(dǎo)和衰老等密切相關(guān)[13]。

大量研究表明，ROS與細(xì)胞凋亡有著緊密聯(lián)系[14]。線粒體可通過呼吸鏈電子漏產(chǎn)生大量的ROS，也可通過線粒體相關(guān)蛋白的活化來誘發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體內(nèi)累積的ROS消耗掉谷胱甘肽（GSH）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPT）開放，細(xì)胞色素C（cytochrome-C，cyt-C）從膜間隙釋放到細(xì)胞質(zhì)與凋亡酶激活因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）及pro-caspase-9構(gòu)成凋亡小體，引起Caspase-9的活化，引發(fā)一系列caspase的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。吳振[15]發(fā)現(xiàn)，紫草素可通過caspase激活的機理來引發(fā)人宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈現(xiàn)時間和濃度的依賴性。通過蛋白酶活力的檢測和caspase抑制劑的使用，已證實Caspase-3和Caspase-8參與了該過程。但通過死亡受體的拮抗實驗未能證實該過程與細(xì)胞凋亡的膜受體通路相關(guān)。Wu等[16]通過Western blot等實驗方法發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠引發(fā)人宮頸癌Hela細(xì)胞中ERKs的磷酸化和上調(diào)p53的表達(dá)水平，但對c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38蛋白的表達(dá)水平無明顯影響，而使用絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK）抑制劑則能抑制ERKs磷酸化，下調(diào)p53的表達(dá)水平，并證實了在此過程中ERKs位于p53的上游，ERK的磷酸化能夠上調(diào)p53的表達(dá)水平。在多種細(xì)胞系中，p53能夠起到調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的作用。Bax作為一種促凋亡蛋白，能夠作用于線粒體上的電壓依賴性離子通道，引起cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，并引發(fā)一系列caspase的級聯(lián)反應(yīng)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白作為一種抗凋亡蛋白，則能夠阻止凋亡形成因子的釋放，p53則能夠通過提高Bax的表達(dá)水平和降低Bcl-2的表達(dá)水平來實現(xiàn)對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。張亞宏等[17]通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等檢測方法發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠引發(fā)人宮頸癌Hela細(xì)胞產(chǎn)生ROS，并上調(diào)p-p38蛋白的表達(dá)水平；通過使用活性氧的清除劑及SB203580（p38的特異性抑制劑）已證實，ROS能夠調(diào)控p38的磷酸化，并誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上，紫草素能夠引發(fā)宮頸癌細(xì)胞生成ROS，并調(diào)控MAPKs的活性，上調(diào)p53的表達(dá)水平，引起B(yǎng)cl-2家族蛋白水平的改變，造成線粒體外膜通透性變化，促進(jìn)cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)一系列caspase的級聯(lián)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。

2.2 通過FAK信號通路

局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種由人類PTK2基因編碼的非受體酪氨酸蛋白激酶。除某些類型的血細(xì)胞外，大多數(shù)細(xì)胞都能夠表達(dá)FAK。FAK與細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲遷移等有著緊密聯(lián)系。抑制FAK的表達(dá)能夠上調(diào)G2/M和G0/G1期的細(xì)胞比率，下調(diào)S期的細(xì)胞比率，干擾細(xì)胞過渡到有絲分裂階段，阻滯細(xì)胞向S期過渡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[18]。FAK酪氨酸激酶活性被激活是細(xì)胞遷移過程中重要的早期標(biāo)志之一。FAK活化可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞與胞外基質(zhì)接觸的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞遷移[19]。研究表明，F(xiàn)AK可通過FAK/PI3K-AKT[20-21]、FAK-RIP[22]等信號通路來實現(xiàn)惡性腫瘤的抗失巢凋亡。在整個細(xì)胞凋亡過程中，F(xiàn)AK是導(dǎo)致細(xì)胞變圓，失去局灶性接觸以及凋亡膜形成的重要因素。FAK的過度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡并增加轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)病率。

近年來，F(xiàn)AK在腫瘤細(xì)胞中的作用機理成為人們研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在卵巢癌[23]、子宮內(nèi)膜癌[24]和宮頸癌[2]等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)水平。郝臻鳳等[2]通過Western blot和實時熒光定量PCR等實驗方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫草素處理后的人宮頸癌Hela細(xì)胞中FAK蛋白和mRNA的表達(dá)水平呈下降趨勢，F(xiàn)AK的磷酸化水平降低，且呈濃度依賴性。而FAK的表達(dá)水平以及磷酸化水平的降低能夠阻礙腫瘤細(xì)胞增殖、引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響其黏附、侵襲和遷移能力。綜上，紫草素能夠通過下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中FAK的表達(dá)水平和磷酸化水平來阻礙細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減低其黏附、侵襲和遷移能力，進(jìn)而達(dá)成抗腫瘤的目的。

3 總結(jié)和展望

紫草素能夠通過ROS/MAPKs/caspase和FAK信號通路來阻礙細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低其黏附、侵襲和遷移能力，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的目的。楊陽等[25]通過細(xì)胞水平免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀等方法發(fā)現(xiàn)，紫草素能夠下調(diào)人宮頸癌鱗癌SiHa細(xì)胞中G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（Gprotein-coupled estrogen receptor1，GPER）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白表達(dá)水平，上調(diào)G0/G1期的細(xì)胞比率，下調(diào)S期的細(xì)胞比率，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。該實驗表明紫草素阻礙宮頸癌細(xì)胞增殖可能是通過GPER通路下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)水平來實現(xiàn)的。而FAK和ERK信號通路同樣可以調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，影響細(xì)胞增殖。那GPER、FAK和ERK三條信號通路在調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖方面是否有一定的聯(lián)系，目前還沒有關(guān)于此方面的研究。Dan等[26]發(fā)現(xiàn)，β-羥基異戊酰紫草素一種天然存在的紫草素衍生物，能夠通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的作用。那紫草素是否能同樣通過此信號通路來抑制宮頸癌的發(fā)展，目前還未見有關(guān)此方面的文獻(xiàn)報導(dǎo)。紫草素于抗宮頸癌方面是否還存在其他作用機制需要進(jìn)一步探索。紫草素等天然小分子物質(zhì)的抗腫瘤效用成為人們近年來關(guān)注的焦點，有望為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2] 郝臻鳳，劉靜，張瑜，等.紫草素對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015， 21（6）：91-94.

[3] 李葉靜，談弋.紫草素通過TLR4/NF-kB信號通路抑制由脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥研究[J].安徽醫(yī)藥，2017， 21（8）：1384-1387.

[4] 曹云飛，李慧芬.紫草化學(xué)成分及其抗病毒、抑菌作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)研究，2014，33（1）：42-43.

[5] Kim Sj，Kim Jm，Shim Sh，et al. Shikonin induces cell cycle arrest in human gastric cancer（AGS）by early growth response 1（Egr1）-mediated p21 gene expression [J]. J Ethnopharmacol，2014，3（3）：1064-1071.

[6] Shi S，Cao H. Shikonin promotes autophagy in BXPC-3 human pancreatic cancer cells through the PI3K/Akt signaling pathway [J]. Oncology Letters，2014，3（3）：1087-1089.

[7] Zhu Y，Zhang YJ，Liu WW，et al. Salidroside Suppresses HUVECs cell injury induced by oxidative stress through activating the Nrf2 signaling pathway [J]. Molecules，2016，21（8）. DOI：10.3390/molecules21081033

[8] Pan BS，Wang YK，Lai MS，et al. Cordycepin induced MA-10 mouse Leydig tumor cell apoptosis by regulating p38 MAPKs and PI3K/AKT signaling pathways [J]. Sci Rep，2015，5：13 372.

[9] O'Neil JD，Ammit AJ，Clark AR. MAPK p38 regulates inflammatory gene expression via tristetraprolin：doing good by stealth [J]. Int J Biochem Cell Biol，2017，94：6-9.

[10] Solinas G，Becattini B. JNK at the crossroad of obesity，insulin resistance，and cell stress response [J]. Mol Metab，2017，6（2）：174-184.

[11] Gong C，F(xiàn)ang J，Li G，et al. Effects of microRNA-126 on cell proliferation，apoptosis and tumor angiogenesis via the down-regulating ERK signaling pathway by targeting EGFL7 in hepatocellular carcinoma [J]. Oncotarget，2017， 8（32）：52 527-52 542.

[12] Eldridge MJ，Sanchez-Garrido J，Hoben GF，et al. The Atypical Ubiquitin E2 Conjugase UBE2L3 is an Indirect Caspase-1 Target and Controls IL-1β Secretion by Inflammasomes [J]. Cell Reports，2017，18（5）：1285-1297.

[13] Shalini S，Dorstyn L，Dawar S，et al. Old，new and emerging functions of caspases [J]. Cell Death Differ，2015，22（4）：526-539.

[14] Circu ML，Moyer MP，Harrison L，et al. Contribution of glutathione status to oxidant-induced mitochondrial DNA damage in colonic epithelial cells [J]. Free Radic Biol Med，2009，47（8）：1190-1198.

[15] 吳振.紫草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機制的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2004.

[16] Wu Z，Wu LJ，Shinichi T，et al. Phosphorylated extracellular signal-regulated kinase up-regulated p53 expression in shikonin-induced HeLa cell apoptosis [J]. Chin Med J（Engl），2005，118（8）：671-677.

[17] 張亞宏，甘瑩，郭子華，等.紫草素通過ROS/p38信號通路誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報，2011，27（6）：864-867.

[18] Zhao J，Pestell R，Guan JL. Transcriptional activation of cyclin D1 promoter by FAK contributes to cell cycle progression [J]. Mol Biol Cell，2001，12（12）：4066-4077.

[19] Sieg DJ，Hauck CR，Ilic D，et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration [J]. Nature Cell Biology，2000，2（5）：249-256.

[20] Fu QF，Liu Y，F(xiàn)an Y，et al. Alpha-enolase promotes cell glycolysis，growth，migration，and invasion in non-small cell lung cancer through FAK-mediated PI3K/AKT pathway [J]. J Hematol Oncol，2015，8（1）：22.

[21] Zheng Y，Gierut J，Wang Z，et al. Protein tyrosine kinase 6 protects cells from anoikis by directly phosphorylating focal adhesion kinase and activating AKT [J]. Oncogene，2013，32（36）：4304-4312.

[22] 何小蕾，李洪嬌，方慧華，等.抗腫瘤新藥靶——黏著斑激酶的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2017，17（2）：92-96.

[23] 王海霞，唐良萏，周琦. NEDD9、FAK在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016（3）：234-238.

[24] Alowayed N，Salker M S，Ni Z，et al. LEFTY2 controls migration of human endometrial cancer cells via focal adhesion kinase activity（FAK）and miRNA-200a [J]. Cell Physiol Biochem，2016，39（3）：815-826.

[25] 楊陽，陶仕英，牛建昭，等.紫草素對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖周期的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2018，11（1）：6-10.

[26] Dan LU，Jing Q，Wei LI，et al. β-hydroxyisovaleryl-shikonin induces human cervical cancer cell apoptosis via PI3K/AKT/mTOR signaling [J]. Oncology Letters，2015，10（6）：3434-3442.

（收稿日期：2018-03-14 本文編輯：李岳澤）