王敏 劉其禮 許帥 李品玉 李俊濤

[摘要] 目的 探討鴉膽子苦醇在非小細胞肺癌A549、H460細胞增殖中的作用。 方法 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測鴉膽子苦醇對A549、H460細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）；Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；通過CCK-8法檢測細胞活力；Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡；Western blot免疫印跡法檢測A549、H460細胞Nrf2、Notch1蛋白表達。 結(jié)果 鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞的IC50分別為（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L；流式細胞試驗結(jié)果顯示，鴉膽子苦醇處理后A549、H460細胞凋亡率顯著升高，與對照組比較差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.01）；Western blot檢測結(jié)果顯示，鴉膽子苦醇可降低細胞內(nèi)Nrf2、Notch1的蛋白表達。 結(jié)論 鴉膽子苦醇可以抑制A549、H460細胞的生長，其機制可能與抑制Nrf2-Notch1信號軸有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 鴉膽子苦醇；非小細胞肺癌；Nrf2；Notch1；細胞生長

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0016-04

Study on the mechanism of the influence of Brusatol for the Nrf2-Notch1 axis of non-small cell lung cancer

WANG Min LIU Qili XU Shuai LI Pinyu LI Juntao

Faculty of Basic Medicine， Zhaoqing Medical College， Guangdong Province， Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Brusatol in the proliferation of A549 and H460 cells of non-small cell lung cancer. Methods The median inhibitory concentration （IC50） of Brusatol for A549 and H460 cells was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. Through hoechst33258 staining， the morphological changes of cell apoptosis were observed under the inverted fluorescence microscope. The cell viability was detected by CCK-8. The cell apoptosis was tested by Annexin-V-FITC/PI staining. The expression of Nrf2 and Notch1 protein of A549 and H460 cells was measured by Western blot. Results The IC50 of A549 and H460 cells dealt with Brusatol was （0.70±0.03）， （0.47±0.05） μmol/L respectively. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rates of A549 and H460 cells dealt with Brusatol were increased obviously， which had highly statistically significant differences compared with those of control group （all P < 0.01）. The results of Western blot showed that Brusatol could decrease the expression of Nrf2 and Notch1 protein. Conclusion Brusatol can inhibit the growth of A594 and H460 cells， the mechanism may be related to the inhibition of Nrf2-Notch1 axis.

[Key words] Brusatol； Non-small cell lung cancer； Nrf2； Notch1； Cell growth

鴉膽子苦醇（Brusatol）是一種苦木內(nèi)酯類化合物，從鴉膽子中提取獲得。鴉膽子苦醇具有抗炎、驅(qū)蟲、抗瘧、抗癌等多種生物學(xué)功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇可調(diào)節(jié)Nrf2信號通路的表達[1]。Nrf2信號通路是內(nèi)源性的抗氧化通路。當(dāng)細胞處于穩(wěn)態(tài)時，細胞內(nèi)Nrf2處于低水平狀態(tài)[2]。當(dāng)細胞受到外界刺激時，Nrf2進入細胞核，與相應(yīng)的抗氧化作用元件結(jié)合，啟動下游一系列抗氧化物酶，如血紅素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases）等的表達，從而起到對機體的防護作用[3]。Kitamura等[4]認為Nrf2及其下游蛋白的高表達與腫瘤細胞的增殖、存活有關(guān)。Notch1信號通路主要參與細胞的分化、凋亡等過程[5]。Natsuizaka等[6]證實抑制Notch1活性可顯著降低腫瘤細胞的增殖和生長速度。有文獻報道，Nrf2信號通路可與Notch1信號通路有交叉互作反應(yīng)，如：Nrf2缺陷表達小鼠中，Notch1表達有所下降[7-8]。目前，鮮見鴉膽子苦醇對Nrf2及Notch1信號通路共同影響的研究，同時，鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌生長、存活的影響機制還不完善。因此，本研究以Nrf2-Notch1信號軸為研究基礎(chǔ)，探討鴉膽子苦醇對非小細胞肺癌生長的影響及作用機制，為非小細胞肺癌靶向藥物的研制提供一定的實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

鴉膽子苦醇購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司（批號：112586）；二甲基亞砜（DMSO）（批號：STBG-9203）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號：STBG9651）購自Sigma公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司（批號：KJ651）；Hoechst33258購自Thermo Fisher公司（批號：1842729）；胎牛血清購自美國Hyclone公司（批號：AB10114599）；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司（批號：1868807）；Nrf2（批號：BL671）、Notch1（批號：BL549）購自Cell Signaling Technology公司；β-actin（批號：CJ39154）、HRP標記的山羊抗兔（批號：CJ36131）購自巴傲得生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549、H460購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）中培養(yǎng)。

1.3 半數(shù)抑制濃度（IC50）計算

將對數(shù)期細胞A549、H460細胞5000個接種于96孔板24 h后，加入不同濃度（0.175、0.35、0.70、1.4、2.8 μmol/L）的鴉膽子苦醇，并以相同濃度的DMSO作為對照，培養(yǎng)48 h后，每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h后，棄上清，加入200 μL DMSO，10 min振蕩后，于酶標儀檢測570 nm處細胞的OD值，并計算細胞IC50。

1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

將對數(shù)期細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞后繼續(xù)孵育24 h，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，加入200 μL Hoechst33258染液，作用5 min，PBS清洗2次，熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 細胞存活的測定

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞24 h后，每孔2000個細胞數(shù)接種于96孔板，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后酶標儀檢測450 nm處細胞OD值，即可間接反映細胞的增殖。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.6 細胞凋亡的檢測

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞24 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗3次，1000 r/min離心5 min（r = 9.5 cm），加500 μL Binding緩沖液重懸細胞，避光，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，流式細胞儀上機檢測。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.7 Western blot檢測蛋白水平

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞24 h后，棄上清，PBS清洗3次，每次5 min，加1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，細胞刮刀收集細胞，超聲破碎細胞，4°C，10 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清。BCA法檢測蛋白濃度，50 μg蛋白進行上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白電泳分離，PVDF轉(zhuǎn)膜后，5%BSA封閉。一抗孵育4°C過夜，次日，二抗室溫2 h，Alpha Innotech FluorChem？郇Q多色熒光凝膠成像分析系統(tǒng)進行曝光，AlphaView SA3.4.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。以上述同樣方法加相同濃度的DMSO作為對照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞增殖的抑制作用

鴉膽子苦醇對A549、H460細胞都有一定的抑制作用。鴉膽子苦醇對A549、H460細胞的IC50分別為（0.70±0.03）、（0.47±0.05）μmol/L。本研究選擇0.70、0.47 μmol/L的鴉膽子苦醇作為處理A549、H460細胞的后續(xù)實驗藥物劑量。

2.2 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞存活的影響

0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇分別處理A549、H460細胞，孵育12、24、48 h后，A549、H460細胞存活降低。H460細胞的抑制效果與A549抑制效果無差異。見圖1。

2.3 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞形態(tài)學(xué)影響

鴉膽子苦醇0.70、0.47 μmol/L分別處理A549、H460細胞24 h后，與對照組均勻熒光比較，A549、H460細胞的細胞核呈現(xiàn)致密濃染顆粒狀狀態(tài)，可見明顯凋亡小體的出現(xiàn)（圖2箭頭所示）。對凋亡小體進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)處理組A549、H460細胞與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

與對照組比較，**P < 0.01

2.4 鴉膽子苦醇對A549、H460細胞凋亡的影響

如圖3所示，A549細胞株中，對照組凋亡率為4.66%，鴉膽子苦醇處理24 h后，細胞凋亡率上升至36.7%；H460細胞株中，對照組凋亡率為5.76%，鴉膽子苦醇處理24 h后，細胞凋亡率上升至53.8%。

2.5 鴉膽子苦醇對Nrf2信號通路的影響

如圖4所示，0.70、0.47 μmol/L鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞24 h后，兩種細胞中Nrf2蛋白被抑制，同時，Notch1蛋白也被抑制。

3 討論

鴉膽子苦醇作為傳統(tǒng)中藥，含有多種苦木內(nèi)酯類化合物，研究表明這類化合物具有抗癌、抗炎、抗瘧疾等多種功效，但目前關(guān)于鴉膽子苦醇的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制研究較少[9]。本研究主要探究鴉膽子苦醇作用于人肺癌細胞的相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。

Nrf2調(diào)控的靶基因主要有各種抗氧化或解毒蛋白，這些靶基因的激活是機體抵御氧化應(yīng)激損傷的主要作用因子。Nrf2信號通路的激活可以抵抗外界對細胞的不利刺激[10]，有研究表明[11]，304例非小細胞肺癌患者組織樣本中，Nrf2蛋白的高表達發(fā)生率為26%。此外Nrf2的高表達在前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌細胞中也被發(fā)現(xiàn)[12-14]，Nrf2的高表達可以增強腫瘤細胞的增殖、輻射抗性和藥物抗性[15]。A549、H460細胞都被證實有Nrf2蛋白的高表達[16]，說明A549細胞和H460細胞具有較強的抗外界刺激的能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇誘導(dǎo)A549細胞的濃度大于鴉膽子苦醇處理H460細胞的濃度，說明A549細胞相比H460細胞具有更強的抗性。鴉膽子苦醇處理A549、H460細胞后，細胞呈現(xiàn)致密濃染的顆粒狀熒光，其細胞核出現(xiàn)凋亡小體，聯(lián)合流式細胞術(shù)檢測結(jié)果，鴉膽子苦醇處理細胞可以誘導(dǎo)非小細胞肺癌發(fā)生凋亡。有研究表明，鴉膽子苦醇是Nrf2的抑制劑[17]。在本研究中，經(jīng)鴉膽子苦醇處理后，非小細胞肺癌A549和H460細胞中Nrf2的蛋白表達明顯降低，推測Nrf2蛋白含量的降低有可能是鴉膽子苦醇誘導(dǎo)細胞凋亡的原因之一。有報道顯示，10%的非小細胞肺癌患者呈現(xiàn)Notch1的高表達狀態(tài)，同時這一高表達與患者低治愈率有關(guān)[18]。下調(diào)Nrf2可降低非小細胞肺癌中Notch1及其下游蛋白Hes1等蛋白的表達[19]。本研究檢測了Notch1蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鴉膽子苦醇處理后的細胞中Notch1的蛋白表達也有所下降，該結(jié)果提示，鴉膽子苦醇有可能是通過抑制Nrf2-Notch1這一信號軸，來實現(xiàn)降低A549、H460細胞增殖與存活并增強腫瘤細胞凋亡的目的。本研究結(jié)果提示，鴉膽子苦醇可以作為治療非小細胞肺癌的潛在藥物，為臨床治療非小細胞肺癌提供一定的指導(dǎo)作用。

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（收稿日期：2018-02-26 本文編輯：張瑜杰）