李洋 李曉薇 徐赫韓

摘 要：植物在外界脅迫環(huán)境中能夠生存得益于它們對(duì)脅迫的快速應(yīng)答和體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（CBL）和CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）信號(hào)通路是一類(lèi)靈敏的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。在眾多植物中都已經(jīng)鑒定出了編碼CBL和CIPK的基因。本文將圍繞CBL/CIPK基因的表達(dá)模式和功能，非生物脅迫下植物CBL和CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上最新的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行綜述，以期為抗逆育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白；CBL相互作用蛋白激酶；非生物脅迫；信號(hào)通路

中圖分類(lèi)號(hào)：S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180631003

CBL-CIPK信號(hào)通路參與了高鹽、干旱、低溫，高PH和低鉀離子等非生物脅迫。類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B like protein，CBL）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CBL interacting protein kinase）都有大量的基因家族成員，每個(gè)成員編碼特定的上游或下游靶蛋白，從而使植物具有應(yīng)對(duì)外界脅迫的能力。對(duì)CBL和CIPK突變體的研究表明當(dāng)植物在遭受干旱、鹽堿、低溫、高溫的脅迫時(shí)CBL和CIPK對(duì)植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。許多CBL和CIPK已經(jīng)證明參與植物的離子運(yùn)輸，它們限制了有毒離子輸送到組織，使植物最大程度地從土壤中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。不同脅迫下CBL-CIPK系統(tǒng)的響應(yīng)具有多樣性，特異性和復(fù)雜性。

1 CBL與CIPK蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

1.1 CBL蛋白結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

CBL蛋白最早在擬南芥中分離得到。該蛋白和動(dòng)物體內(nèi)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin B，CNB）及酵母中神經(jīng)元鈣感應(yīng)器（Neuronal Calcium Sensors ，NCS）的B亞基具有高度相似性[1]。CBL蛋白含有4個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)（EF-hands），4個(gè)EF手性的間距是不變的，從EF1到EF4依次相距22，25和32個(gè)氨基酸距離[2]。每個(gè)EF手性結(jié)構(gòu)都含有負(fù)責(zé)與Ca2+結(jié)合的保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)[3]。環(huán)區(qū)域的特征是含有12個(gè)氨基酸殘基DKDGDGKIDFEE的共有序列[4]。1（X），3（Y），5（Z），7（-X），9（-Y）和12（-Z）位置的氨基酸負(fù)責(zé)與Ca2+結(jié)合。EF1在X和Y位置處插入2個(gè)氨基酸殘基。這些位置結(jié)構(gòu)的變化隨之產(chǎn)生與Ca2+結(jié)合的親和力變化[5]。CBL蛋白可以根據(jù)其N(xiāo)-末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分為2個(gè)主要亞組。第1組由CBL1，CBL4，CBL5，CBL8和CBL9組成，N末端結(jié)構(gòu)域，含有43～48個(gè)氨基酸， N-末端發(fā)生豆蔻?；５?組由蛋白質(zhì)CBL2，CBL3，CBL6，CBL7和CBL10組成，具有延伸的N-末端結(jié)構(gòu)域，類(lèi)似來(lái)自NCS組的K+通道互作蛋白（K+ Channel Interaction Proteins，KChIP），不含有可辨別的脂質(zhì)修飾基序。在第2個(gè)亞組CBL10具有非常長(zhǎng)的N端結(jié)構(gòu)，延伸形成潛在的單跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)CBL10的定位非常重要[6]。

1.2 CIPK蛋白結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征CIPKs被歸類(lèi)為蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)激酶（Sucrose non-fermenting 1，SNF1 ）也稱為SnRK3蛋白。CIPK蛋白由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：保守的N末端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，有可以磷酸化的激活環(huán)，激活環(huán)中氨基酸磷酸化使激酶激活，與其它植物蛋白激酶中發(fā)現(xiàn)的N末端激酶結(jié)構(gòu)域類(lèi)似；FISL基序（也稱為NAF）和PPI基序組成的C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，由高度保守的氨基酸Asn（N），Ala（A），Phe（F），Ile（I），Ser（S）和Leu（L）組成的NAF基序是結(jié)合CBL蛋白所必須的，NAF基序與CIPK的C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合以覆蓋其激活環(huán)，而使激酶處于自身抑制狀態(tài)[7]。PPI基序是與磷酸酶相互作用的具有自我抑制作用。

2 CBL-CIPK途徑的分子機(jī)制

CBL-CIPK復(fù)合物在對(duì)外界脅迫中起非常重要的作用。CIPK蛋白通過(guò)磷酸化N末端保守的絲氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)它們與CBL蛋白的相互作用，CIPK基因家族在擬南芥，水稻，玉米，和甘藍(lán)型油菜中都證實(shí)了這一功能[8]。CBL-CIPK途徑在調(diào)節(jié)鈉離子（Na+）[9]，鉀離子（K+），鎂離子（Mg2+），硝酸鹽離子（NO3-）和質(zhì)子（H+）穩(wěn)態(tài)，以及調(diào)節(jié)離子運(yùn)輸系統(tǒng)方面也有重要作用[10]。

CBL和CIPK蛋白的結(jié)構(gòu)特征為它們的相互作用提供了基礎(chǔ)。CBL蛋白中EF手性排列的差異導(dǎo)致在脅迫下CBL-CIPK復(fù)合物對(duì)鈣親和力不同。鹽敏感（ Salt Overly Sensitive，SOS）途徑是第1個(gè)被鑒別出的CBL-CIPK網(wǎng)絡(luò)，包含SOS3 類(lèi)類(lèi)鈣調(diào)磷酸酶B蛋白CBL4和SOS2類(lèi)蛋白激酶CIPK型激酶CIPK24。CBL4-CIPK24/S0S3-S0S2復(fù)合物定位到細(xì)胞膜上，激活Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以增強(qiáng)耐鹽性[11]。CBL4通過(guò)其EF手性域附著Ca2+導(dǎo)致其活性發(fā)生改變[3]，有利于CBL4通過(guò)NAF基序與CIPK24相互結(jié)合。這種結(jié)合使CIPK24的構(gòu)象發(fā)生變化并暴露其激活，即CIPK24的自抑制狀態(tài)解除，活化的CIPK24磷酸化Na+/H+交換器從細(xì)胞中排出過(guò)量的Na+[12-15]。

3 不同植物中CBL-CIPK的研究

3.1 擬南芥中CBL-CIPK的研究

擬南芥中有26種CIPK，屬于SOS2類(lèi)蛋白家族。CIPKs不能直接與鈣離子作用，需要CBL作為鈣傳感器以消除CIPKs中激酶的自抑制作用。與CIPK相互作用的CBL蛋白有10種，屬于SOS3類(lèi)蛋白家族均定位在細(xì)胞膜或液泡膜上，推斷是因?yàn)榧?xì)胞膜和液泡膜是重要的鈣貯存部位使CBL-CIPK復(fù)合物可以在不同脅迫下快速調(diào)節(jié)鈣離子濃度形成特定的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)答系統(tǒng)，該網(wǎng)絡(luò)在擬南芥中調(diào)節(jié)鈣離子、鈉離子、鉀離子、硝酸根離子、磷酸根離子和ABA穿過(guò)細(xì)胞膜和液泡膜[16，18]。鈣離子在植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)和植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是一個(gè)重要的信使。在擬南芥中已經(jīng)鑒定了4個(gè)主要的Ca2+傳感器，包括鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-

dependent protein kinase，CDPK），鈣調(diào)磷酸酶B樣蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL），鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CAM），蛋白樣蛋白（ Calmodulin-like，CML）[19，20]。

除了包含激酶結(jié)構(gòu)域的CDPK外，其他3種Ca2+傳感器沒(méi)有酶結(jié)構(gòu)域，這意味著它們?cè)诩?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的下游起作用。

3.2 小麥中CBL-CIPK的研究

在植物中，CBL-CIPK信號(hào)通路在非生物脅迫中起關(guān)鍵作用。然而，由于小麥的六倍體性質(zhì)，所以在作為重要主食的小麥中對(duì)CBL-CIPK功能研究較少。小麥基因組中有4個(gè)CBL蛋白79個(gè)CIPK蛋白。鹽（NaCl）、H2O2、干旱（PEG）和冷（4℃）脅迫下，對(duì)小麥幼苗根和葉中2種TaCBLs和5種TaCIPKs的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。TaCIPK31在ABA誘導(dǎo)的根中顯著上調(diào)，在鹽脅迫下，TaCIPK24在根和葉中上調(diào)，TaCBL9，TaCIPK7，TaCIPK15，TaCIPK24，和TaCIPK32由H2O2誘導(dǎo)。冷處理導(dǎo)致上調(diào)的基因數(shù)量最多，沒(méi)有基因在根或葉中被冷脅迫下調(diào)[21，22]。小麥的TaCIPK2基因，在聚乙二醇，脫落酸和H2O2處理的小麥葉片中上調(diào)表達(dá)。在滲透和干旱脅迫條件下，過(guò)表達(dá)TaCIPK2的轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出更高的耐旱性；轉(zhuǎn)TaCIPK2基因煙草植物的失水率和離子滲漏較低，丙二醛和過(guò)氧化氫含量較低[23]。以上結(jié)果表明，TaCIPK2在轉(zhuǎn)基因煙草的干旱脅迫中發(fā)揮了重要的作用。

3.3 大豆中CBL-CIPK的研究

大豆（ Glycine max ）作為人類(lèi)生產(chǎn)生活中食用油和動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，使它成為了最重要的豆類(lèi)作物[24]。大豆全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但是基因組水平上對(duì)CBL-CIPK基因家族的表征鮮有報(bào)道，干旱脅迫下大豆CIPK基因家族包含52個(gè)基因（GmCIPK1至GmCIPK52）并分為4個(gè)亞組（I至IV）。對(duì)52個(gè)大豆CIPK家族基因表達(dá)模式的分析表明，大多數(shù)大豆CIPK基因內(nèi)含子是干旱誘導(dǎo)型的； 使用公開(kāi)的Affymetrix微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)分析CIPK基因的基因表達(dá)模式，在干旱的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，發(fā)現(xiàn)20個(gè)基因被上調(diào)，葉中28個(gè)被下調(diào)。在生殖階段，在干旱脅迫下，葉片中發(fā)現(xiàn)有33個(gè)被上調(diào)，15個(gè)下調(diào)。在干旱發(fā)生階段，18個(gè)基因上調(diào)，13個(gè)基因在2個(gè)發(fā)育階段都顯示出不穩(wěn)定的下調(diào)。確認(rèn)了18個(gè)CIPK基因是干旱誘導(dǎo)型[25]。

3.4 其他植物中CBL-CIPK的研究

植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫有許多調(diào)控機(jī)制，近幾年來(lái)CBL-CIPK參與的植物生理功能研究越來(lái)越多。通過(guò)幾個(gè)全基因組的基因表達(dá)譜指出了各種蛋白基因家族的作用，為研究干旱脅迫機(jī)制提供了高效的數(shù)據(jù)[26]。表達(dá)分析表明，水稻中包括10個(gè)CBL和30個(gè)CIPK，它們不僅參與非生物脅迫，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。在水稻中通過(guò)OsCIPK23的過(guò)表達(dá)可以提高干旱相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)改善水稻耐旱性[27]；有文獻(xiàn)表明棉花GhCIPK6被干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)，干旱脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)GhCIPK6的擬南芥進(jìn)行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)AtCBL1和AtCBL4表達(dá)水平增加，說(shuō)明在脅迫下GhCIPK6與CBL共同參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，玉米的ZmCIPK21在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)，超表達(dá)玉米ZmCIPK21的擬南芥在鹽脅迫下脫水反應(yīng)性元件結(jié)合蛋白DREB1B和DREB1C基因上調(diào)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性；油菜籽中的CBL4在酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）測(cè)定中證明與CIPK24相互作用，過(guò)表達(dá)油菜籽CBL4基因的擬南芥比野生型擬南芥具有更高耐鹽性。

4 展望

非生物脅迫下植物中CBL-CIPK信號(hào)通路會(huì)與多種逆境相關(guān)信號(hào)通路相互作用，如早期發(fā)現(xiàn)的低鉀離子響應(yīng)途徑，硝酸鹽傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及ABA信號(hào)通路等。近期又發(fā)現(xiàn)了新的與CBL-CIPK相互作用的途徑，包括赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、氧氣匱乏通路、葡萄糖信號(hào)通路和ROS通路。由于CBL–CIPK網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，未來(lái)對(duì)于CBL–CIPK的研究應(yīng)該更趨于系統(tǒng)化，并運(yùn)用現(xiàn)代的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。組學(xué)（如轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的聯(lián)合分析）和生物信息學(xué)研究有助于闡明CBL–CIPK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)演化的多樣性和各成員的功能。另外，對(duì)于CBL–CIPK各成員在不同植物中、不同的逆境脅迫中以及植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中的相互作用，都應(yīng)該加強(qiáng)關(guān)注。

相信隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子育種手段的成熟與完善，深入解析CBL-CIPK信號(hào)通路，有效放大和應(yīng)用各基因成員的功能，將在非生物脅迫方面為農(nóng)作物的抗性育種做出貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Cho J H，Lee J H，Park Y K，et al.Calcineurin B-like Protein CBL10 Directly Interacts with TOC34 （Translocon of the Outer Membrane of the Chloroplasts） and Decreases Its GTPase Activity in Arabidopsis[J].Front Plant Sci，2016（7）.

[2]Trupkin S A，Auge G A，Zhu J K，et al.SALT OVERLY SENSITIVE 2 （SOS2） and Interacting Partners SOS3 and ABSCISIC ACID–INSENSITIVE 2 （ABI2） Promote Red-Light-Dependent Germination and Seedling Deetiolation in Arabidopsis[J].International Journal of Plant Sciences，2017，178（6）：485-493.

[3]Wang X，Zhang H，Gao H，et al.Research Progress on the Mechanism of CBL-CIPK Signaling Pathways in Response to Abiotic Stress[J].Molecular Plant Breeding，2017.

[4]Tang R J，Zhao F G，Garcia V J，et al.Tonoplast CBL–CIPK calcium signaling network regulates magnesium homeostasis in Arabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（10）：3134.

[5]Simon B，Huart A S，Wilmanns M.Molecular mechanisms of protein kinase regulation by calcium/calmodulin.[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2015，23（12）：2749.

[6]Steinhorst，Leonie，M?hs，et al.Vacuolar CBL-CIPK12 Ca2+-Sensor-Kinase Complexes Are Required for Polarized Pollen Tube Growth[J].Current Biology，2015，25（11）：1475-1482.

[7]Thoday-Kennedy E L，Jacobs A K，Roy S J.The role of the CBL–CIPK calcium signalling network in regulating ion transport in response to abiotic stress[J].Plant Growth Regulation，2015，76（1）：3-12.

[8]Zhang H，Yang B，Liu W Z，et al.Identification and characterization of CBL and CIPK gene families in canola （ Brassica napus，L.）[J].Bmc Plant Biology，2014，14（1）：8.

[9]Zhao X，Wei P，Liu Z，et al.Soybean Na + /H +，antiporter GmsSOS1，enhances antioxidant enzyme activity and reduces Na +，accumulation in Arabidopsis and yeast cells under salt stress[J].Acta Physiologiae Plantarum，2017，39（1）：19.

[10]Zhou X，Hao H，Zhang Y，et al. PKS5/CIPK11，a SnRK3-Type Protein Kinase，is Important for ABA Responses in Arabidopsis through Phosphorylation of ABI5[J]. Plant Physiology，2015.

[11]Zhu M，Shabala L，Cuin T A，et al. Nax loci affect SOS1-like Na+/H+ exchanger expression and activity in wheat[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67（3）：835-844.

[12]Sánchezbarrena M J，F(xiàn)ujii H，Angulo I，et al. The Structure of the C-Terminal Domain of the Protein Kinase AtSOS2 Bound to the Calcium Sensor AtSOS3[J]. Molecular Cell，2007，26（3）：427.

[13]Wang J，Liang Y，Wang J，et al.Protein Kinase CIPK1 from Bruguierab Gymnorhiza and coding gene and use thereof：，WO/2015/042733[P].2015.

[14]Feki K，Brini F，Ben A S，et al.Comparative functional analysis of two wheat Na+/H + antiporter SOS1 promoters in Arabidopsis thaliana under various stress conditions[J].Journal of Applied Genetics，2015，56（1）：15-26.

[15]Wang X P，Chen L M，Liu W X，et al.AtKC1 and CIPK23 synergistically modulate AKT1-mediated low potassium stress responses in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2016，170（4）：01493.

[16]Batistic O，Kudla J.Plant calcineurin B-like proteins and their interacting protein kinases.[J].Biochimica Et Biophysica Acta，2009，1793（6）：985-992.

[17]Sanyal S K，Rao S，Mishra L K，et al.Plant Stress Responses Mediated by CBL–CIPK Phosphorylation Network[M]// The Enzymes Volume 40.Developmental Signaling in Plants.2016：31-64.

[18]Dong L，Wang Q，Manik S M，et al.Nicotiana sylvestris calcineurin B-like protein NsylCBL10 enhances salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J].Plant Cell Reports，2015，34（12）：2053-2063.

[19]Zhou L，Lan W，Chen B，et al.A Calcium Sensor-Regulated Protein Kinase，CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN-INTERACTING PROTEIN KINASE19，Is Required for Pollen Tube Growth and Polarity.[J].Plant Physiology，2015，167（4）：1351-60.

[20]Reddy AS， Ali GS， Celesnik H，et al.Coping with stresses： roles of calcium-and calcium/calmodulin-regulated gene expression[J]. Plant Cell，2011（23）：2010–2032.

[21]Xiong G，Liu X，Qiu P，et al.Rice grassy stunt virus p5 interacts with two protein components of the plant-specific CBL-CIPK Ca2+ signaling network of rice[J].Virus Genes，2017：1-8.

[22]Wang Y，Sun T，Li T，et al.A CBL-Interacting Protein Kinase TaCIPK2 Confers Drought Tolerance in Transgenic Tobacco Plants through Regulating the Stomatal Movement[J].Plos One，2016，11（12）：e0167962.

[23]Deng X，Zhou S，Hu W，et al.Ectopic expression of wheat TaCIPK14，encoding a calcineurin B-like protein-interacting protein kinase，confers salinity and cold tolerance in tobacco.[J].Physiol Plant，2013，149（3）：367–377.

[24]Schmutz J，Cannon S B，Schlueter J，et al.Genome sequence of the palaeopolyploid soybean[J].Nature，2010， 463（7278）：178-183.

[25]Zhu Kaikai，Chen Fei， Liu J，et al.Evolution of an intron-poor cluster of the CIPK gene family and expression in response to drought stress in soybean[J].Scientific Reports，2016（6）.

[26]Hadiarto T，Tran LS.Progress studies of drought-responsive genes in rice[J].Plant Cell Rep，2011（30）：297– 310.

[27]王毅，武維華，李娟，et al.Application of OsCIPK23 protein to cultivation of low-potassium stress-resistant plant：CN 103451227 A[P].2013.

作者簡(jiǎn)介：李洋（1993-），女，碩士生在讀，研究方向：植物基因工程與抗逆分子生物學(xué)；李海燕（1971-），女，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：大豆等油料作物逆境生理與分子育種。