胡 萍 彭 蔚 吳名桃 劉 婷

1.江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院婦科，江西萍鄉(xiāng) 337000；2.江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院超聲科，江西萍鄉(xiāng) 337000

上皮性卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，具有隱匿性，臨床早期診斷缺乏特異性指標(biāo)和診斷方法，當(dāng)疾病被確診時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)發(fā)展為癌癥晚期，導(dǎo)致病死率較高[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)水平的逐步提高，通過對腫瘤標(biāo)志物水平的診斷和檢測，使上皮性卵巢癌的臨床診斷率顯著提高，但仍然受到一定的限制，因此選擇更加具有特異性的診斷標(biāo)志物對改善患者預(yù)后具有積極意義。近年來，有相關(guān)學(xué)者認(rèn)為miRNA可以參與到細(xì)胞發(fā)育、凋亡、分化以及新陳代謝等多種病理生理過程，并且在腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有大量miRNAs存在[2]。為此，本研究對上皮性卵巢癌患者組織中miR-92表達(dá)以及在卵巢癌發(fā)生及發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用作如下研究分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)同意下，在我院2007年1 月～2017年12月收治的各期上皮性卵巢癌患者、上皮性卵巢良性腫瘤患者以及因生殖器官（除卵巢外）良性病變而行單側(cè)或雙側(cè)卵巢切除患者中各隨機(jī)選擇300例分別作為卵巢癌組、良性卵巢腫瘤組與正常卵巢組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均簽署書面知情同意書；年齡為18～80歲；卵巢癌組研究對象經(jīng)病理檢查明確患有卵巢癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅳ期；良性卵巢腫瘤組為同期于我院確診為卵巢良性腫瘤的患者，且接受單側(cè)或雙側(cè)手術(shù)治療；正常卵巢組為同期于我院因生殖器官（除卵巢外）良性病變而行單側(cè)或雙側(cè)卵巢切除的患者，未患有卵巢疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有卵巢交界性腫瘤者；伴有其他嚴(yán)重器質(zhì)性惡性腫瘤的患者[3]。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 人卵巢癌細(xì)胞株SKVO3購自于上海拜力生物科技有限公司；正常卵巢組織、上皮性卵巢癌組織以及上皮性卵巢良性腫瘤組織均由萍鄉(xiāng)市人民區(qū)醫(yī)院病理科所提供；TM2000由美國Invitrogen公司提供；DMEM以及Opti-MEM無血清培養(yǎng)基均由Gibco公司所提供；轉(zhuǎn)染用的脂質(zhì)體由Lipofectamine提供；miR-92反義寡核苷酸以及對照核苷酸均由上海吉瑪公司提供；細(xì)胞增殖檢測試劑盒由廣州市銳博生物科技有限公司提供；熒光素探針細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司；實(shí)施定量PCR試劑由美國Ap-plied Biosystems提供。

1.2.2 提取樣本總DNA 將保存的組織樣本500 μl置于冰上解凍后，利用預(yù)冷的PBS液對標(biāo)本進(jìn)行洗滌，共洗滌2次，將樣本放入研缽后加入1 ml Trizol后，進(jìn)行充分的研磨，提取總RNA。之后對OD280以及OD260的吸光度值進(jìn)行檢測，并測定RNA的濃度以及質(zhì)量[4]。

1.2.3 合成cDNA 取0.5 μg吸光度比值為1.8～2.1的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，分別加入焦炭酸二乙酯水以及miR-92逆轉(zhuǎn)錄引物，總體積保持在13 μl。在25℃條件下，共持續(xù)反應(yīng)5 min，并將其置于冰上2 min，之后加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μl，加入RNA酶抑制劑以及逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，保證20 μl的總體積。之后設(shè)定反應(yīng)條件為40℃，反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為1 h，并在70℃下反應(yīng)10 min，得到cDNA產(chǎn)物，并將產(chǎn)物放在-20℃的冰箱中保存[5]。

1.2.4 檢測miR-92水平 配置反應(yīng)體系，取1 μl cDNA模板，miR-92的特異性前向引物、通用反向引物各 1 μl，2×SYBR Green Master Mix， 最后添加無菌蒸餾水，使總體積達(dá)到20 μl。將反應(yīng)條件設(shè)置為95℃，反應(yīng)時(shí)間 5 min，之后在 9、57、72℃下各反應(yīng) 30 s（循環(huán)此操作40次），同時(shí)U6作為對照[6]。將每例標(biāo)本實(shí)施復(fù)孔檢測，共重復(fù)檢測2次，對每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)預(yù)定閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)進(jìn)行詳細(xì)記錄，并作為Ct值，再次對Ct值進(jìn)行檢測，所取平均值即為樣本的Ct值，同時(shí)將U6 snRNA作為內(nèi)參，對Ct值進(jìn)行檢測，并對樣本miRNA水平利用2-△Ct法進(jìn)行計(jì)算，其中△Ct=CtmiR-CtU6[7]。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄對比三組組織標(biāo)本中的miR-92水平，分析miR-92水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫瘤分化程度等病理類型之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組標(biāo)本組織中miR-92水平的比較

卵巢癌組的miR-92表達(dá)水平為（0.645±0.550），高于良性卵巢腫瘤組的（0.491±0.025），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.810，P=0.001）；正常卵巢組的 miR-92 表達(dá)水平（0.384±0.016）低于卵巢癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.157，P=0.001）；正常卵巢組的miR-92表達(dá)水平低于良性卵巢腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.439，P=0.001）。

2.2 卵巢癌組患者miR-92表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系分析

臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的miR-92表達(dá)水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-92水平高于未轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌組患者miR-92表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系分析（±s）

表2 卵巢癌組患者miR-92表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系分析（±s）

臨床資料 例數(shù) miR-92表達(dá)水平 t值 P值年齡（歲）＜50≥50臨床分期（期）Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ組織學(xué)類型漿液性其他分化程度低分化中、高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1.2150.225 146 154 0.554±0.035 0.514±0.069 42.1630.001 114 186 0.445±0.046 0.763±0.072 1.5650.119 173 127 0.634±0.058 0.645±0.063 44.6060.001 106 194 0.514±0.034 0.861±0.076 28.2870.001有無89 211 0.678±0.044 0.556±0.029

3 討論

上皮性卵巢癌是較為常見的婦科惡性腫瘤，由于其缺乏特異性的診斷指標(biāo)，患者病情確診時(shí)，多數(shù)已經(jīng)發(fā)展至晚期，導(dǎo)致上皮性卵巢癌患者的死亡率較高[8]。雖然近年來醫(yī)療技術(shù)水平不斷得到提高，通過采用手術(shù)以及其他治療方法，可使患者5年生存率得到相應(yīng)提高，但是仍然處于較低水平，所以選擇特異性的診斷指標(biāo)，提高臨床診斷準(zhǔn)確率對改善患者預(yù)后有著重要意義[9-10]。

目前糖鏈抗原是診斷上皮性卵巢癌的常用標(biāo)志物，但是在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，此標(biāo)志物對于診斷上皮性卵巢癌的特異性和敏感性不夠優(yōu)良，所以選擇新的腫瘤標(biāo)志物對改善患者預(yù)后具有積極意義[11-12]。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，相關(guān)研究顯示，在腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展過程中，miRNA具有重要的調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)控靶基因表達(dá)，其對細(xì)胞的生長、繁殖以及凋亡造成影響，所以miRNA表達(dá)與癌癥的產(chǎn)生、病理分期以及分化轉(zhuǎn)移存在較大關(guān)聯(lián)[13-15]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測法對三組組織樣本中的miR-92表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組的miR-92表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常卵巢組以及良性腫瘤組，提示利用miR-92表達(dá)水平能夠良好地對疾病類型實(shí)施判斷。通過進(jìn)一步對miR-92表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，研究結(jié)果提示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的miR-92水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-92水平高于未轉(zhuǎn)移者，提示miR-92可參與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，并且上皮性卵巢癌患者的miR-92表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及腫瘤分化程度存在較大的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，miR-92可作為上皮性卵巢癌診斷的輔助指標(biāo)，可為臨床診療提供重要的參考依據(jù)和指導(dǎo)方向。