李 姣， 朱曉換， 古 蕾， 王亞男

（四川師范大學生命科學學院，四川成都610101）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上僅次于大米、小麥和玉米的第4大糧食作物.馬鈴薯易受病毒感染，馬鈴薯病毒嚴重影響其產(chǎn)量和品質.其中馬鈴薯卷葉病毒是最具破壞性的馬鈴薯病毒，普遍分布在世界（包括中國）大多數(shù)馬鈴薯種植地區(qū)［1］.馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）是黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus）的代表成員，通過蚜蟲傳播.PLRV侵染馬鈴薯植株，引起卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網(wǎng)狀壞死等癥狀，導致馬鈴薯嚴重減產(chǎn)，重者減產(chǎn)80%以上.

大規(guī)模組織培養(yǎng)無病毒種薯生產(chǎn)是控制馬鈴薯病毒病的主要方法，然而優(yōu)良無病毒種薯的生產(chǎn)要求建立快速、準確、靈敏的可應用于大規(guī)模樣本的病毒檢測技術.目前馬鈴薯病毒檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）2種.ELISA因為操作簡單而被廣泛應用于馬鈴薯病毒檢測，然而，靈敏度較低和假陰性結果的干擾等缺點大大限制了其檢測的準確性［2］.RT-PCR比ELISA更敏感，也常用于馬鈴薯病毒檢測［3-5］.然而，RT-PCR檢測過程需要4個步驟，先后分別是：1）從植物組織中提取RNA；2）逆轉錄反應（RT）；3）聚合酶鏈反應（PCR）；4）通過瓊脂糖凝膠電泳成像可視化其反應產(chǎn)物.因此，RTPCR的過程復雜且耗時，使其不能滿足對大規(guī)模樣本進行快速病毒檢測的要求.逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術（RT-LAMP）［6-11］是一種用具有鏈置換活性的 Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶以逆轉錄所得的cDNA為模板，通過2對（或3對）引物于65℃（Bst DNA聚合酶的最適溫度）恒溫條件下擴增的技術.其擴增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應液本身所含有的鎂離子結合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂［6-8］.RT-LAMP反應只需1個恒溫水浴鍋，在1 h內(nèi)完成，因此是一種簡單、快速和成本低的馬鈴薯病毒檢測方法.然而，在RT-LAMP檢測中，制備RNA模板不僅是檢測的第一個步驟，也是保證檢測結果準確的基礎［8］.目前主要使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法等方法從待測植物樣品中提取總RNA作為RT-LAMP擴增的模板，這些方法操作復雜，提取時間較長，同時提取液中含有的苯酚、氯仿等試劑易對環(huán)境造成污染.在對大規(guī)模樣本進行病毒檢測的過程中，RNA模板的提取已成為檢測過程中耗時耗力最多的一個環(huán)節(jié).本研究將無菌大頭針的針尖刺感染馬鈴薯卷葉病毒的馬鈴薯植株的莖尖，用粘附在針尖處的微量植物組織汁液直接進行RT-LAMP擴增.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，此RNA是RT-LAMP擴增用的模板.其擴增產(chǎn)物通過肉眼觀察便可檢測出該植株有無感染PLRV，從而建立一種無需RNA模板制備，無需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色，快速檢測PLRV的方法.該方法大大減少了檢測時間和成本，且操作簡便，應用于對大規(guī)模樣本的病毒檢測，在大規(guī)模組織培養(yǎng)無病毒種薯生產(chǎn)中有很大的應用空間.本研究之所以采用馬鈴薯莖尖提取微量組織汁液，原因有2點：1）高細胞密度的莖尖可以使足夠量的組織汁液粘附在針尖處；2）植物細胞含有干擾 RTLAMP和RT-PCR反應的抑制劑，而莖尖細胞含有的抑制劑較少，能減少對RT-LAMP和RT-PCR反應的干擾.

1 材料與方法

1.1 供試植株 實驗所用植株為培養(yǎng)室中生長的馬鈴薯組培苗，其品種為“紫花白”.待測樣品包括經(jīng)ELISA法鑒定已感染PLRV的6份樣品和沒有感染PLRV的6份樣品.陽性對照：已感染PLRV的馬鈴薯組培苗；陰性對照1：沒有感染PLRV的馬鈴薯組培苗；陰性對照2：以ddH2O為模板的RTPCR或RT-LAMP擴增產(chǎn)物.

1.2 實驗試劑 植物組織總RNA提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；5X TRUE RT MasterMix逆轉錄反應試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、Moloney Murine Leukemia Virus（MMLV）逆轉錄酶（美國Promega公司）、2X Utaq PCR MasterMix試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；Bacillus stearothermophilus（Bst）DNA 聚合酶（美國 New England Biolabs公司）、10X ThermoPol反應緩沖液（美國 New England Biolabs公司）、RNase抑制劑（美國Promega公司）、甜菜堿（美國Sigma公司）；瓊脂糖和Goldview核酸染料（均購自北京中科瑞泰生物科技有限公司）、DL2000 DNA相對分子質量標準和6X上樣緩沖液（均購自南京生興生物技術有限公司）.

1.3 引物 本研究中檢測的PLRV的基因為PLRV外殼蛋白的編碼序列（ORF3），共627個堿基對（bp）.RT-PCR和RT-LAMP反應所用的引物及引物序列和當有PLRV感染植株時擴增的目的片段如表1所示.所有引物均由成都擎科生物技術公司提供.表1中RT-PCR反應所用的引物為正向引物F和反向引物B，當有PLRV感染植株時，其反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為一條長627 bp的條帶.RT-LAMP反應所用的引物為1對外引物（F3／B3）和1 對內(nèi)引物（FIP／BIP），當有PLRV 感染植株時，其反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為瀑布狀的DNA片段.

表1 RT-PCR和RT-LAMP反應中所用引物的序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-PCR and RT-LAMP

1.4 實驗儀器 Bio-Rad PCR儀 C1000（美國Bio-Rad公司）；Bio-Rad水平15×10 cm Sub-Cell GT電泳槽1704481（美國Bio-Rad公司）；Bio-Rad Powerpac Basic基礎電源1645050（美國Bio-Rad公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) SYSTEM GelDoc XR+（美國Bio-Rad公司）；HH-6恒溫水浴鍋（常州朗博儀器制造有限公司）.

1.5 實驗方法

1.5.1 植物組織總RNA提取 按照傳統(tǒng)的RNA模板的制備方法，將剪下的莖尖組織（長約0.1 cm）放入事先盛有液氮的研缽中，充分研磨，然后按照北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供的植物組織總RNA提取的說明書，用該公司提供的植物組織總RNA提取試劑盒進行操作.

1.5.2 微量組織汁液采集 如圖1所示，使用無菌大頭針的針尖刺馬鈴薯組培苗（苗高6～8 cm）莖尖，莖尖汁液隨之粘附在針尖處.在RT-PCR實驗中，先將針尖浸在逆轉錄（RT）反應液中，通過隨機引物，總RNA（PLRV和馬鈴薯的RNA）被逆轉錄為總 cDNA，然后轉移適量 RT反應液（總量為0.5μg DNA）到PCR反應液中，通過1對引物（表1中F／R），病毒DNA被擴增為長627 bp的片段.在RT-LAMP實驗中，將針尖浸在反應液中，由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反應液中先被M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶通過2對引物（表1中 F3／B3和 FIP／BIP）擴增.其擴增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應液本身所含有的鎂離子結合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂［6-8］.如有白色沉淀，即可判定為帶PLRV植株；如沒有白色沉淀的出現(xiàn)，即可判定為無病毒植株.

圖1 微量組織汁液采集示意圖Fig.1 Illustration of collecting micro-tissue juice

1.5.3 RT-PCR RT-PCR 反應首先對傳統(tǒng)法提取的RNA模板或者微量組織汁液中含有的RNA進行RT反應，然后對RT反應產(chǎn)物進行PCR擴增.

傳統(tǒng)的RT反應體系的總體積為20μL，其中各成分含量為：1μg RNA和4μL 5X TRUE RT Master-Mix（該試劑包含M-MLV逆轉錄酶和一對隨機引物）.各成分配置完成后，以雙蒸水補齊至20μL，于42℃恒溫反應20 min，獲得DNA模板，隨后于85℃放置5 s，使逆轉錄酶失活，終止反應.

微量組織汁液直接RT反應體系總體積為20μL，成分同傳統(tǒng)的 RT反應體系，只是不加RNA，以雙蒸水補齊至20μL.將粘附了莖尖汁液的針尖浸在RT反應體系中，室溫中反應15 min，獲得DNA模板，隨后于85℃放置5 s，使逆轉錄酶失活，終止反應.操作中，盡量使粘附了莖尖汁液的針尖完全浸在RT反應體系中，并蓋嚴管蓋，否則會影響RT反應結果.

PCR反應體系總體積為25μL，其中各成分含量為：12.5 μL 2X Utaq PCR MasterMix、10 μM 正反向引物各1μL、0.5μg DNA模板.各成分配置完成后，以雙蒸水補齊至25μL，放入Bio-Rad PCR儀中進行PCR擴增.PCR反應條件包括：1）預變性：94 ℃，3 min；2）30 個循環(huán)：94 ℃，30 s；54 ℃，1 min；72 ℃，30 s；3）末次延伸：72 ℃，7 min.其反應產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測.

1.5.4 RT-LAMP 傳統(tǒng)的RT-LAMP反應體系總體積為25μL，其中各成分含量為：1.6μM內(nèi)引物 FIP／BIP、0.4 μM外引物 F3／B3、2.5 μL 10X ThermoPol緩沖液、0.8 M betaine、1.0 mM dNTP、8 mM MgSO4、10 U M-MLV 逆轉錄酶、4 U RNase抑制劑、10 U Bst DNA聚合酶和0.1μg DNA模板.各成分配置完成后，以雙蒸水補齊至25μL，于65℃恒溫反應60 min，隨后放置于80℃ 5 min，使逆轉錄酶失活，終止反應.

微量組織汁液直接RT-LAMP反應體系總體積為25μL，其中各成分含量同傳統(tǒng)的RT-LAMP反應體系，只是不加DNA模板，以雙蒸水補齊至25μL.將粘附了莖尖組織汁液的針尖浸在RTLAMP反應體系中，于65℃恒溫反應60 min，隨后于85℃放置5 s，使逆轉錄酶失活，終止反應.操作中，盡量使粘附了莖尖組織汁液的針尖完全浸在RT-LAMP反應體系中，并蓋嚴管蓋，否則會影響RT-LAMP反應結果.

1.5.5 質量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像 將0.45 g的瓊脂糖放入30 mL 1X TAE緩沖液中溶解，滴入1.5μL Goldview核酸染料（比例：5μL核酸染料／100 mL 1X TAE緩沖液），倒入膠模中，室溫靜置約30 min，使膠完全凝固.把膠放入裝有適量1X TAE緩沖液的Bio-Rad凝膠電泳儀的電泳槽內(nèi)，分別往孔道中加入6μL DL2000 DNA相對分子質量標準和6μL RT-PCR或RT-LAMP反應產(chǎn)物的混合液（比例：1μL反應產(chǎn)物／5μL 6X上樣緩沖液）后，蓋上電泳槽，通電1～5 V／cm，使DNA向陽極移動.電泳完畢后，取出凝膠，在Bio-Rad成像系統(tǒng)中檢查凝膠并拍照.

2 結果與討論

2.1 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測馬鈴薯卷葉病毒方法的建立 大規(guī)模組織培養(yǎng)無病毒種薯，能大大減少馬鈴薯卷葉病毒對生產(chǎn)的危害，然而，在其生產(chǎn)過程中尤為需要對大規(guī)模樣本進行快速的病毒檢測.因此，本研究構建了微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測馬鈴薯卷葉病毒方法，即用無菌大頭針刺馬鈴薯植株的莖尖，將粘附了組織汁液的針尖浸在RT-LAMP反應液中，于65℃恒溫反應60 min.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA，病毒RNA在RT-LAMP反應液中先被M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA，然后cDNA被Bst DNA聚合酶在針對馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白基因ORF3的2對引物（表1中F3／B3和 FIP／BIP）作用下進行擴增.其擴增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段（見圖2B中的瀑布狀片段）.同時伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，該離子與反應液本身所含有的鎂離子結合形成肉眼可視的白色沉淀-焦磷酸鎂.如有白色沉淀，即可判定為帶PLRV植株；如沒有白色沉淀的出現(xiàn)，即可判定為無病毒植株.

2.2 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測馬鈴薯卷葉病毒方法的可靠性 圖2A：馬鈴薯莖尖直接RT-LAMP反應的肉眼觀察所得的結果.PCR管+：陽性對照（已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品），反應液中出現(xiàn)白色沉淀；PCR管-：陰性對照（未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品），反應液清澈，無白色沉淀.圖2B：質量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析以微量組織汁液為模板直接RTLAMP法及RT-PCR法和以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP法及RT-PCR法的實驗結果.泳道M：DL2000 DNA相對分子質量標準；泳道W：以ddH2O為模板擴增的結果；泳道-：未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測結果；泳道+：已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測結果：1）以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板擴增的檢測結果；2）以莖尖汁液為模板直接擴增的檢測結果.

由圖2可知，微量組織汁液直接RT-LAMP檢測PLRV的結果與以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP檢測PLRV的結果一致，說明微量組織汁液直接RT-LAMP檢測馬鈴薯卷葉病毒的方法是可靠、可行的.通過肉眼觀察反應產(chǎn)物中有無白色沉淀來判定植株是否感染病毒的方法與瓊脂糖凝膠電泳分析法的結果一致，說明通過肉眼觀察反應產(chǎn)物中有無白色沉淀來判定植株是否感染病毒的方法是可靠、可行的.

圖2 利用引物對PLRV ORF3序列進行RT-PCR和RT-LAMP擴增的結果Fig.2 Amplification results of PLRV ORF3 sequence using primers in RT-PCR and RT-LAMP

3 結束語

該方法不僅限于對馬鈴薯卷葉病毒的檢測，還可通過設計針對其它病毒靶基因序列的引物，應用于其它病毒（如水稻黑條矮縮病毒［12］、草莓輕型黃邊病毒［13］）的檢測中.該方法與以往的檢測方法相比，具有以下3個優(yōu)點.1）迅速：該方法無需RNA提取，無需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色，減少了至少2～3 h的檢測時間；2）操作簡便：RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像的操作難度較大，需要具備一定操作技能的人員經(jīng)過一段時間反復試驗才能掌握其操作技術.該方法無需RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像，操作十分簡便，任何人員都可迅速掌握其操作技術；3）成本低：RT-PCR檢測法需要PCR儀，然而一個價格最低的PCR儀花費上萬元.RT-PCR和RT-LAMP的反應產(chǎn)物需要瓊脂糖凝膠電泳成像進行檢查和分析，然而價格最低的電泳儀和成像系統(tǒng)花費上萬元.該方法只需要一個任何實驗室都具備的儀器——恒溫水浴鍋，因此大大減少了檢測成本.雖然該方法靈敏度不及RTPCR（如圖2B所示），但其所具有的3個優(yōu)點使其適用于對大規(guī)模脫病毒樣本的病毒檢測，在大規(guī)模組織培養(yǎng)無病毒種薯、花卉和苗木生產(chǎn)中具有很大的應用空間，而且它適用于任何一個植物病毒檢測機構，特別是實驗設備相對簡單、操作人員技能相對有限的基層機構.