張利文，王艷玲

（沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué)遼陽(yáng)分校 石油化工學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 111003）

橘子類(lèi)水果是全世界產(chǎn)量最大的水果，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)植物。皮渣作為其主要副產(chǎn)物，占柑橘總量的20%～40%，具有較大的利用價(jià)值[1]。柑橘皮中含有豐富的生物活性物質(zhì)——黃酮類(lèi)化合物，黃酮類(lèi)藥物具有抗腦缺血、抗心肌缺血、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、抗病毒和抗腫瘤等作用[2]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

橘皮、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、NaOH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)室用蒸餾水。

1.1.2 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器有限公司）、水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、三頻超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）、粉碎機(jī)（順德品科仕榮模具有限公司）、電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）、循環(huán)水抽濾泵（陜西太康生物科技有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將橘皮置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥48 h，取出后用小型研磨機(jī)研磨，并且在80目篩上以得到干燥的橘皮粉末，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱(chēng)取0.015 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中加熱至60 ℃，并加入60%乙醇溶液，在超聲波儀器中溶解后，將其轉(zhuǎn)移到50.00 mL的容量瓶中，用60%乙醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.30 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25.00 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1.00 mL搖勻，靜置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，6 min后加入4%NaOH溶液1.00 mL，最后用60%的乙醇水溶液定容，20 min后開(kāi)始測(cè)量吸光度值。用蒸餾水溶液為空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)量吸光度值，以濃度為橫向坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制了蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度

1.2.3 總黃酮的提取

稱(chēng)取1.00 g橘皮干粉，加入一定濃度的乙醇水溶液30 mL為提取劑，在一定溫度下加熱提取一定時(shí)間，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算在不同的乙醇濃度比條件總黃酮的提取得率。

1.2.4 總黃酮的測(cè)定

在25.00 mL容量瓶中加入一定量的類(lèi)黃酮提取液，并加入1.00 mL 5% NaNO2的溶液搖晃，放置6 min，再加入1.00 mL 10% Al(NO3)3溶液，6 min后加入4% NaOH溶液1.00 mL，再用60%乙醇水溶液定容至刻度，搖晃，靜置20 min，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取率的影響

稱(chēng)取1.00 g橘皮干粉5份，分別加入50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在60 ℃下加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算在不同的乙醇濃度比條件總黃酮的提取得率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乙醇水溶液濃度對(duì)提取效果的影響

由表1可知，乙醇濃度由50%增加至90%時(shí),總黃酮含量隨之不斷增加，但80%時(shí)增長(zhǎng)比較緩慢，原因是乙醇濃度過(guò)低時(shí)，橘皮中黃酮化合物不能完全溶解到溶液中，并且隨著乙醇濃度增大，溶解度增加，收率增加，但乙醇濃度太大時(shí)，黃酮被阻止進(jìn)一步提取出來(lái)。因此選擇80%乙醇水為最佳濃度。

2.2 提取溫度對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取率的影響

稱(chēng)取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在40、50、60、70 ℃和80 ℃下分別加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，硝酸鋁顯色法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算在不同的溫度條件下總黃酮的提取得率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溫度對(duì)提取效果的影響

由表2可知，超聲溫度從40 ℃升高到80 ℃，橘皮中黃酮含量先增加后減少，在70 ℃時(shí)達(dá)到最大值?？傸S酮含量減少的原因是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，由于強(qiáng)烈的熱效應(yīng)而被破壞，有效成分被破壞，收率降低。因此，選擇70 ℃為超聲溫度。

2.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取率的影響

稱(chēng)取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在60 ℃下分別加熱提取10、20、30、40 min和50 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算在不同時(shí)間條件下總黃酮的提取得率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加熱時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由表3可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量先增加后減少。原因可能是超聲時(shí)間短，類(lèi)黃酮化合物不能完全溶解出來(lái)，所以產(chǎn)量低；隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮全都溶解出來(lái)，收率增加；繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，超聲波產(chǎn)生大量的熱和空化效應(yīng)，可能破壞了橘皮中黃酮的結(jié)構(gòu)，最后得率降低。因此選擇水浴加熱時(shí)間40 min。

2.4 料液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取率的影響

稱(chēng)取1.00 g橘皮干粉5份，分別加入60%乙醇水溶液10、20、30、40 mL和50 mL為提取劑，在60 ℃下加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算在不同的料液比條件下總黃酮的提取得率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 料液比對(duì)提取效果的影響

表4表明，總黃酮含量隨著料液比的升高而升高，但料液比在一定比例后，總黃酮含量也隨之下降。原因可能是當(dāng)料液比過(guò)小時(shí)，橘皮中黃酮類(lèi)化合物不能完全溶解到于溶液中，所以得收率較低，隨著料液比過(guò)大時(shí)，溶解度增加，得率增加，但料液比過(guò)大時(shí)，溶解在溶液中的黃酮濃度被稀釋?zhuān)章史炊档?。因此選擇1∶30為最佳料液比。

2.5 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、提取溫度為研究因素，根據(jù)橘皮總黃酮收率，確定水浴加熱輔助提取總黃酮的最佳提取條件，因素水平見(jiàn)表5。

表5 總黃酮提取L9（34）因素、水平設(shè)計(jì)

按照正交試驗(yàn)表操作，得數(shù)據(jù)如表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6可看出，R極差B＞D＞A＞C，即料液比對(duì)產(chǎn)率影響最大，其次是溫度、乙醇濃度與提取時(shí)間。從K值大小可看出，正交試驗(yàn)最優(yōu)水平為A2B3C3D3，即提取溫度為75 ℃，乙醇濃度為80%、料液比為1∶35、提取時(shí)間為45 min。這個(gè)條件不在正交試驗(yàn)的9次試驗(yàn)中，為了確定試驗(yàn)的可靠性，必須在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.6 最佳工藝條件驗(yàn)證及結(jié)果

按照上述得出的最佳提取條件，對(duì)橘皮中黃酮提取液進(jìn)行3次平行提取，測(cè)定提取物吸光度值，計(jì)算出平均得率，得率如表7所示。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，3次平行提取試驗(yàn)的平均產(chǎn)收率為2.19%，正交試驗(yàn)表6中的最高的2.1%，說(shuō)明該結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

采用超聲波提取技術(shù)來(lái)提取橘皮中總黃酮，以乙醇作為提取溶劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)橘皮中總黃酮提取率的影響。優(yōu)化后的超聲波輔助法提取橘皮總黃酮工藝參數(shù)為：提取溫度75℃、乙醇濃度80%、料液比1∶35、提取時(shí)間為45 min，此條件下得率為2.19%。