任峻，宋迎亞

（凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州凱里 556011）

百合（Lilium brownii var. Viridulum）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物，是一種集觀賞、食用、藥用、化妝為一體的花卉[1]。對(duì)于百合的組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)50年代，Robb首先利用百合鱗片進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得成功[2]。我國(guó)在20世紀(jì)80年代初開展了百合的組織培養(yǎng)研究[3-5]，為百合組織培養(yǎng)研究奠定了基礎(chǔ)[2]。在組織培養(yǎng)技術(shù)之前，均采用傳統(tǒng)的鱗莖球繁殖方法，繁殖速度緩慢，特別是經(jīng)多代繁殖以后，常造成種性退化，甚至病毒積累，影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。實(shí)現(xiàn)百合種球組織培養(yǎng)是一項(xiàng)有效途徑[7]，既能縮短繁殖周期，增加繁殖系數(shù)，又能減少病毒侵害幾率[8]。可見，開展百合組織培養(yǎng)育苗工作十分必要。目前還沒有對(duì)產(chǎn)自貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)的野百合的研究報(bào)道，本研究以貴州鎮(zhèn)遠(yuǎn)百合鱗片為材料進(jìn)行了組織培養(yǎng)，為百合種球的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選用生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的野百合鱗莖，本實(shí)驗(yàn)所用百合采自貴州黔東南州鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣羊場(chǎng)鎮(zhèn)，2017年11月采集自然生境生長(zhǎng)的野百合鱗莖，采集回來種植在實(shí)驗(yàn)園地，隨時(shí)取用。取用百合鱗片作為本次試驗(yàn)的外植體。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

海爾冰箱（BCD-268TN）、光照恒溫培養(yǎng)箱（G2X250C）、全自動(dòng)數(shù)顯立式高壓滅菌器（YXQ-LS-755Ⅱ）、超凈工作臺(tái)（JH-1S）、電磁爐（SK2002）、賽多利斯天平（BSA124S）、pH測(cè)定儀（TEW-Ⅲ）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 配制培養(yǎng)基

配制MS基本培養(yǎng)基母液，稱取NH4NO31600 mg、KNO31900 mg、CaCl2·2H2O 440 mg、MgSO4·7H2O 370 mg、KH2PO4170 mg、KI 0.83 mg、H3BO36.2 mg、MnSO4·H2O 16.9 mg、ZnSO4·7H2O 8.6 mg、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg、CuSO4·5H2O 0.025 mg、CoCl2·6H2O 0.025 mg、Na2EDTA·2H2O 37.3 mg、FeSO4·7H2O 27.8 mg、甘氨酸 2.0 mg、鹽酸硫胺素0.4 mg、鹽酸吡哆醇 0.5 mg、煙酸 0.5 mg、肌醇100 mg、蔗糖30 g，加蒸餾水溶解，定容至1 L，pH調(diào)節(jié)至5.7。按照實(shí)際需求稀釋培養(yǎng)基母液。配制母液需要用剛制備的蒸餾水，以保證母液濃度的準(zhǔn)確性，配好的母液需清澈透明才能使用。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后pH值一般要降低，所以在滅菌前調(diào)pH值時(shí)要相應(yīng)調(diào)高0.1～0.2。

1.3.2 滅菌

將配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中（33 mL/瓶）。把燒杯（1000 mL、500 mL、250mL、100mL各1個(gè)）、培養(yǎng)皿（100mm一套）、濾紙、槍形鑷、解剖刀等實(shí)驗(yàn)用品分別用報(bào)紙和橡皮筋包扎好，整齊規(guī)范地放入全自動(dòng)數(shù)顯立式高壓滅菌器中，121℃、101kPa滅菌20 min。

1.3.3 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料

將采集的百合鱗片用洗潔精輕輕清洗一遍，用大量自來水清洗數(shù)遍，直到水清澈明亮，瀝干水備用。

1.3.4 接種

用75%的酒精對(duì)超凈工作臺(tái)臺(tái)面進(jìn)行消毒，打開紫外燈和通風(fēng)開關(guān)，將接種所需要的材料和用具放入超凈工作臺(tái)滅菌。滅菌后開始接種，首先用75%的酒精噴灑雙手，把已洗凈瀝干水的百合鱗片放入燒杯中，用75%的酒精消毒15 s，無菌水沖洗5次，再用0.1%的次氯酸鈉溶液消毒8 min，無菌水沖洗5次，最后用0.1%升汞溶液消毒10min，無菌水沖洗5次，消毒時(shí)要讓消毒液將百合鱗片完全浸泡。消毒完后瀝干水放入墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在點(diǎn)燃的酒精燈旁將百合鱗片切成1mm×1mm大小的外植體，用槍形鑷接種到培養(yǎng)瓶中，每瓶接種3個(gè)外植體。再次接種前需要將解剖刀和槍形鑷放在酒精燈外焰上灼燒，避免其所帶的細(xì)菌在接種過程中污染外植體，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 培養(yǎng)

1.3.5.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對(duì)NAA、6-BA設(shè)置了6個(gè)不同的濃度梯度（見表1），將鱗片外植體接種于該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)3次。

1.3.5.2 不定芽分化培養(yǎng)

不定芽分化培養(yǎng)基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對(duì)NAA、6-BA設(shè)置了6個(gè)不同的濃度梯度（見表1），選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、顏色黃、塊大的愈傷組織，切為正方形小塊，接種到配制好的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽分化培養(yǎng)。

1.3.5.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對(duì)NAA、6-BA設(shè)置了4個(gè)不同的濃度梯度（見表1），將長(zhǎng)勢(shì)好、高1～3 cm的不定芽接種到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

1.3.6 培養(yǎng)條件

把接種好外植體的培養(yǎng)瓶放入光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，溫度25℃。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)；分化率=分化個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)；用方差分析（One-way ANOVA）分別檢驗(yàn)誘導(dǎo)率、分化率和生根率的總體差異性，用LSD法比較組間差異性。

表1 不同培養(yǎng)基外源激素用量（單位：mg/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果分析

誘導(dǎo)個(gè)體每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)90個(gè)誘導(dǎo)個(gè)體。愈傷組織萌發(fā)率在6組激素之間存在顯著的差異性（F=1248.60，df=5，p＜0.001，One-way ANOVA），萌發(fā)率由⑤、③、⑥、④、①、②依次顯著降低，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA為誘導(dǎo)鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合愈傷組織的最佳激素組合，而激素1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA最不適合誘導(dǎo)鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合生長(zhǎng)愈傷組織。

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)率

2.2 不定芽分化培養(yǎng)結(jié)果分析

不定芽長(zhǎng)勢(shì)在6組激素之間存在顯著的差異性（F=4850.06，df=5，p＜0.001），長(zhǎng)勢(shì)④、（③=⑥）、⑤、②、①依次顯著下降，如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激素組1.5mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA比較適合分化鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合不定芽生長(zhǎng)，而激素組1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不適合分化鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合不定芽生長(zhǎng)。

2.3 生根培養(yǎng)結(jié)果分析

根長(zhǎng)勢(shì)在4種培養(yǎng)基中之間存在顯著的差異性（F=279.74，df=3，p＜0.001），根長(zhǎng)勢(shì)由③、②、④、①依次顯著變差，如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激素組別1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA比較適合鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合生根，激素組別1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不適合鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合生根。NAA的濃度不宜太高，太高不利于根的生長(zhǎng)，綜合來看，NAA的濃度在1.0mg/L 比較合適。

圖2 不定芽分化培養(yǎng)分化率

圖3 生根培養(yǎng)生根率

3 結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中的基本培養(yǎng)基有很多種，選擇正確的基本培養(yǎng)基是成功的起點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中選擇的MS基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基。而植物組織培養(yǎng)中的外源激素種類也很多，選擇NAA、6-BA這兩種外源激素作為本次實(shí)驗(yàn)的外源激素，是因?yàn)檫@兩種外源激素在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用較多，生長(zhǎng)素在組織培養(yǎng)中的主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)芽還是長(zhǎng)根。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比得知，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合組織培養(yǎng)的影響中，誘導(dǎo)鎮(zhèn)遠(yuǎn)野百合愈傷組織生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；最佳不定芽分化培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳生根培養(yǎng)基配方為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。其他的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其他的激素濃度配比也有適合的可能，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。