肖曉琳， 王 凱， 張 兵， 劉建秀

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所， 江蘇 南京210014)

鹽脅迫是制約植物生長(zhǎng)的重要因素之一，是農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)方面急需解決的嚴(yán)峻問(wèn)題。我國(guó)目前約有80%的鹽堿荒地丞待開(kāi)發(fā)利用，草坪草作為生態(tài)建設(shè)和綠地建設(shè)的重要組成部分，通常可作為鹽堿地改良的先鋒植物。培育耐鹽性強(qiáng)的草坪草是改善鹽漬土地綠化和建設(shè)的重要措施，也是近年來(lái)草坪草育種的重要方向。溝葉結(jié)縷草(Zoysiamatrella)是禾本科(Gramineae)畫(huà)眉草亞科(Chloridoideae)結(jié)縷草屬(Zoysia)的多年生暖季型草坪草，是一種極耐鹽的草坪草草種[1,2]，目前已有一些研究結(jié)果初步解析了溝葉結(jié)縷草耐鹽機(jī)制，如Kenneth等[3]發(fā)現(xiàn)溝葉結(jié)縷草能通過(guò)葉片上的鹽腺選擇性分泌鹽離子，緩解植株體內(nèi)鹽離子毒害，同時(shí)還能通過(guò)積累甜菜堿、脯氨酸、可溶性糖等有機(jī)物質(zhì)，緩解植物體在鹽脅迫下產(chǎn)生的不良反應(yīng)[4]。目前關(guān)于植物對(duì)NaCl的反應(yīng)的生理機(jī)制已有較為詳細(xì)的描述[5]，但在分子機(jī)制的研究方面，僅有少量結(jié)縷草屬植物的耐鹽基因研究，如Oishi等[6]從細(xì)葉結(jié)縷草(Zoysiatenuifolia)中克隆了甜菜堿醛脫氫酶ZBD1，并證實(shí)其可能與耐鹽功能相關(guān)；Du等[7]發(fā)現(xiàn)日本結(jié)縷草(ZoysiajaponicaL.)NHX基因家族成員ZjNHX1作為液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用，在日本結(jié)縷草的耐鹽性和離子穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。Chen[8]等在溝葉結(jié)縷草中篩選發(fā)掘出一系列能夠顯著提高酵母耐鹽性候選基因，為后續(xù)溝葉結(jié)縷草耐鹽基因研究奠定重要基礎(chǔ)。

植物在受到逆境環(huán)境因素的影響下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或發(fā)生錯(cuò)誤折疊堆積會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)，主要途徑有錯(cuò)誤折疊蛋白的降解、修正蛋白錯(cuò)誤折疊、細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)、自噬等。大量研究顯示這些途徑與植物耐鹽功能相關(guān)[9-13]。

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein Disulfide Isomerase，PDI)屬硫氧還蛋白亞家族成員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種重要的折疊催化劑，能通過(guò)催化蛋白形成二硫鍵(氧化活性)和催化錯(cuò)誤配對(duì)二硫鍵的重排(異構(gòu)酶活性)來(lái)促進(jìn)蛋白的正確折疊。PDI同時(shí)也具有分子伴侶功能，在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。典型的PDI具有4個(gè)TRX樣結(jié)構(gòu)域，a-b-b'-a'[13]。Eun等發(fā)現(xiàn)擬南芥PDI5對(duì)延緩細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程有影響作用，PDI2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)中調(diào)整蛋白質(zhì)的折疊[14]。Han等研究發(fā)現(xiàn)水稻中PDIL1-1缺失會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)并觸發(fā)PCD[15]。這些研究表明PDI基因與植物耐鹽機(jī)制密切相關(guān)，但關(guān)于溝葉結(jié)縷草等耐鹽草坪草種PDI基因的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究擬對(duì)溝葉結(jié)縷草中的PDI基因進(jìn)行克隆，并對(duì)克隆得到的PDI基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)等的比較分析，隨后使用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其互補(bǔ)鹽敏感酵母生長(zhǎng)表型進(jìn)行了觀察，最后詳細(xì)分析不同PDI基因的組織表達(dá)特異性和鹽脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)特異性。這些研究結(jié)果對(duì)研究溝葉結(jié)縷草等耐鹽草坪草種的鹽脅迫調(diào)控分子機(jī)制和培育耐鹽草坪草新品種提供了重要的理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 植物材料

溝葉結(jié)縷草材料‘Diamond’(品種編號(hào)Z123)(以下稱(chēng)溝葉結(jié)縷草)為2001年引進(jìn)的美國(guó)品種,材料取自江蘇南京江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所試驗(yàn)地。將從地里取的新鮮材料匍匐莖剪成帶有2個(gè)節(jié)點(diǎn)的2～3 cm的莖節(jié)，種植于裝有石英砂的帶孔小塑料杯中在1/2 Hongland營(yíng)養(yǎng)液中水培至生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，根據(jù)需要取相應(yīng)組織材料-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 依據(jù)已發(fā)表的擬南芥、水稻、玉米等植物PDI基因家族成員信息[16]及本課題組前期對(duì)溝葉結(jié)縷草耐鹽相關(guān)基因的篩選結(jié)果[8]，在溝葉結(jié)縷草基因組(http://zoysia.kazusa.or.jp/)中進(jìn)行同源Blast搜索找到5個(gè)PDI基因序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF全長(zhǎng)引物ZmPDI1-F/R、ZmPDI2-F/R、ZmPDI3-F/R、ZmPDI4-F/R、ZmPDI5-F/R，使用Primer primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物(見(jiàn)表1)。

表1 ZmPDI基因表達(dá)引物Table 1 Set of primers for ZmPDI genes expression

續(xù)表1

1.2.2基因克隆 使用-80℃下保存的葉片材料提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用ORF全長(zhǎng)引物擴(kuò)增得到保守區(qū)序列。將目的片段連接載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂板在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.3鹽脅迫下的表達(dá)模式分析 將試驗(yàn)地采集的材料匍匐莖剪成帶有2個(gè)節(jié)點(diǎn)的2～3 cm的莖節(jié)，1/2 Hongland營(yíng)養(yǎng)液水培法培養(yǎng)約30天直至發(fā)根，待生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后取根、莖、葉材料-80℃保存?zhèn)溆?。之后進(jìn)行鹽處理在營(yíng)養(yǎng)液中加入20 g·L-1NaCl處理72小時(shí)，分別在處理3，6，12，24，48，72 h時(shí)取葉片-80℃保存。統(tǒng)一提取RNA后用于熒光定量PCR檢測(cè)，分析不同PDI基因的組織表達(dá)特異性及鹽脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)特異性。

1.2.4酵母表達(dá)系統(tǒng)功能驗(yàn)證 對(duì)測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切后連接到經(jīng)同樣雙酶切的pYES2載體上，經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證連接成功后，將構(gòu)建成功的酵母表達(dá)載體pYES2-ZmPDI分別轉(zhuǎn)化EUG1缺失突變體酵母菌株，涂板于SD/-His/-Ura的酵母培養(yǎng)基生長(zhǎng)至單克隆出現(xiàn)。挑取陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功后，將各梯度稀釋的每種菌液點(diǎn)在含有不同濃度NaCl的SD/-His/-Ura的酵母培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～7天，觀察其生長(zhǎng)狀況差異。

2 結(jié)果分析

2.1 目的基因ZmPDIs的克隆

以溝葉結(jié)縷草cDNA為模板，以ZmPDI1-F/R、ZmPDI2-F/R、ZmPDI3-F/R、ZmPDI4-F/R、ZmPDI5-F/R為引物，進(jìn)行目的基因ORF全長(zhǎng)擴(kuò)增，分別獲得條帶(圖1)。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確，表明成功獲取目的基因ORF全長(zhǎng)。

圖1 ZmPDIs基因的克隆Fig.1 Cloning of ZmPDIs

2.2 生物信息學(xué)分析

我們?cè)跍先~結(jié)縷草基因組中共克隆得到5個(gè)PDI基因，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度范圍1 098～1 533 bp，編碼蛋白氨基酸數(shù)范圍為364～510個(gè)(表2)。根據(jù)NCBI BLAST搜索、Pfam結(jié)構(gòu)域確認(rèn)和基因結(jié)構(gòu)分析，證實(shí)克隆得到的這5個(gè)基因均為ZmPDI基因家族成員(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明ZmPDIs與玉米、水稻PDI親緣關(guān)系較近且存在高度重復(fù)擴(kuò)增。蛋白結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證證實(shí)，5個(gè)ZmPDIs基因均含有TRX樣結(jié)構(gòu)域，屬PDI基因家族特征[16]，根據(jù)含有TRX結(jié)構(gòu)域數(shù)目和位置的分類(lèi)[17]，5個(gè)ZmPDIs基因分為3組與其他物種PDI基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明ZmPDIs與擬南芥、玉米、水稻PDI同源性均較高(圖3，4，5)。

表2 ZmPDI基因家族信息Table 2 The information of ZmPDI gene family

圖2 ZmPDI基因家族進(jìn)化樹(shù)、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Phylogenetic tree,gene structure and conserved motif analysis of ZmPDI genes注：紅色圓形代表溝葉結(jié)縷草PDI基因；藍(lán)色代表玉米；黃色代表水稻；綠色代表擬南芥Note：The red circle represents the PDI gene of Zoysia japonica;blue represents corn;yellow represents rice;green represents Arabidopsis

圖3 ZmPDI1、2、3與其他物種PDI基因氨基酸序列一致性比對(duì)Fig.3 Alignment of amino acid sequence of ZmPDI1、2、3with PDIs from other plant species

圖4 ZmPDI4基因與其他物種PDI基因氨基酸序列一致性比對(duì)Fig.4 Alignment of amino acid sequence of ZmPDI4with PDIs from other plant species

圖5 ZmPDI5基因與其他物種PDI基因氨基酸序列一致性比對(duì)Fig.5 Alignment of amino acid sequence of ZmPDI5 with PDIs from other plant species

2.3 ZmPDI基因表達(dá)模式分析

2.3.1組織表達(dá)特異性 熒光定量結(jié)果顯示，5個(gè)ZmPDI基因在不同組織中均有表達(dá)，然而也存在較大的差異。具體體現(xiàn)在5個(gè)基因在根、莖、葉中均有分布，在莖中表達(dá)量則最高，且顯著高于葉、根中表達(dá)量(圖6)。

圖6 ZmPDI在不同組織中表達(dá)分析Fig.6 ZmPDI expression in different organs of Zoysia matrella

2.3.2誘導(dǎo)表達(dá)特異性 熒光定量結(jié)果進(jìn)一步顯示，在300 mM NaCl處理下，5個(gè)ZmPDI基因的表達(dá)量總體均有不同程度的上調(diào)，ZmPDI1、ZmPDI5的表達(dá)量在處理6 h時(shí)迅速升高并達(dá)到最大值；ZmPDI2、ZmPDI4在處理6 h時(shí)表達(dá)量有所下降，但在處理12 h時(shí)達(dá)到最大值。ZmPDI3的表達(dá)量則是在處理后逐漸升高并在處理12 h時(shí)達(dá)到最大值。其中ZmPDI4、ZmPDI5表達(dá)量在達(dá)到最大值后下降又升高，且接近最大值。表明鹽處理對(duì)ZmPDI基因的表達(dá)具有誘導(dǎo)效果(圖7)。

圖7 ZmPDI在鹽處理后的葉片中的表達(dá)分析Fig.7 ZmPDI expression in leaf under salt treatment

2.4 酵母突變體功能互補(bǔ)耐鹽驗(yàn)證

EUG1突變體菌株在含有500 mM NaCl的YPDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受抑制證明其鹽敏感性。分別轉(zhuǎn)化pYES2-ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3、ZmPDI4、ZmPDI5和轉(zhuǎn)入pYES2空載體的EUG1突變體菌株在不含NaCl的SD/-His/-Ura的平板上30℃培養(yǎng)3～7天后生長(zhǎng)情況并無(wú)差別；而在含有500 mM NaCl的SD/-His/-Ura培養(yǎng)基上，則可以觀察到轉(zhuǎn)化ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3、ZmPDI4基因的重組酵母比轉(zhuǎn)入空載體pYES2的酵母隨著菌液稀釋倍數(shù)的增加生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)愈加顯著但轉(zhuǎn)化ZmPDI5的酵母生長(zhǎng)狀況并無(wú)改善(圖8)。結(jié)果顯示ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3、ZmPDI4提高了鹽敏感酵母的耐鹽性。

3 討論

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的影響因子。植物受到外界不良環(huán)境因素影響后產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ERS)，需要通過(guò)未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response,UPR)來(lái)緩解[18]。PDI是UPR的組成部分，并且通過(guò)其活性位點(diǎn)WCGHC參與二硫鍵的催化形成(還原或異構(gòu)化)和協(xié)助多肽折疊[19-21]。

圖8 ZmPDI轉(zhuǎn)化酵母在0mM和500mM NaCl處理下耐鹽鑒定Fig.8 Salt-tolerance confirmation of ZmPDI transformed yeast cells under 0mM or 500mM NaCl treatment

本研究從溝葉結(jié)縷草中克隆得到5個(gè)ZmPDI基因，5個(gè)基因中除ZmPDI4和ZmPDI5外，ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3序列差異較小，在進(jìn)化關(guān)系上，ZmPDI與水稻、玉米中的PDI親緣關(guān)系較近。同源比對(duì)結(jié)果表明PDI基因家族是相對(duì)保守的蛋白，其在不同物種中的同源性均較高。

酵母在植物耐脅迫基因的功能分析中得到了廣泛應(yīng)用[22]，其中直系同源基因能夠補(bǔ)充功能喪失突變酵母是一個(gè)較為直接的方法[23-24]。酵母PDI基因家族共有5個(gè)成員：PDI1,EUG1,EPS1,MPD1和MPD2[25]其中缺失PDI1使酵母致死[26]。本研究使用EUG1缺失突變體酵母菌株驗(yàn)證ZmPDIs是否可以影響酵母耐鹽功能。結(jié)果顯示，在不含NaCl的平板上所有酵母生長(zhǎng)情況并無(wú)明顯差異而在含鹽平板上轉(zhuǎn)化ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3、ZmPDI14的重組酵母的生長(zhǎng)情況要明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)入空載體的酵母，表明這4個(gè)ZmPDI基因能夠提高鹽敏感酵母的耐鹽性。鹽脅迫使酵母細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，PDI可通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開(kāi)，穩(wěn)定細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[27]，從而改善酵母細(xì)胞耐鹽性。ZmPDI5在本實(shí)驗(yàn)中不能使酵母耐鹽性有所改善，甚至使其生長(zhǎng)更差，考慮到該基因蛋白結(jié)構(gòu)為不同于其余4個(gè)基因的PDI家族中第Ⅲ型[17]，且在鹽處理下，ZmPDI5在處理6 h時(shí)表達(dá)量迅速升高到最大值，但在處理24 h時(shí)已迅速下降接近于0，與其他幾個(gè)PDI基因誘導(dǎo)表達(dá)模式有較大差異，其可能通過(guò)拮抗酵母體內(nèi)PDI蛋白活性從而影響細(xì)胞的正常鹽脅迫應(yīng)答，其具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明和分析。

熒光定量結(jié)果顯示，ZmPDIs在溝葉結(jié)縷草不同組織中，表達(dá)量有明顯差異，5個(gè)PDI基因均在莖中表達(dá)量最高。ZmPDIs雖在正常葉片中表達(dá)量較低，但在鹽處理的情況下，其表達(dá)量均有顯著上調(diào)。為了適應(yīng)鹽脅迫，植物會(huì)通過(guò)促進(jìn)或抑制一些基因的表達(dá)激活一些特殊的分子生化和生理反應(yīng)[28]。擬南芥AtPDI1，AtPDI5，AtPDI6，AtPDI9，AtPDI10和AtPDI11在UPR化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，研究表明這些基因很可能被上調(diào)以增加ERS中的蛋白質(zhì)折疊能力[13]。ZmPDI在鹽誘導(dǎo)下表達(dá)明顯上調(diào)，提示其可能參與溝葉結(jié)縷草未折疊蛋白應(yīng)答對(duì)所受鹽脅迫逆境的緩解，但其具體作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究首次從溝葉結(jié)縷草中克隆得到5個(gè)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)基因。5個(gè)溝葉結(jié)縷草PDI基因中，ZmPDI1、ZmPDI2、ZmPDI3、ZmPDI4能夠提高鹽敏感型酵母突變體耐鹽性。5個(gè)ZmPDI基因在溝葉結(jié)縷草根、莖、葉組織中均有表達(dá)并在莖中表達(dá)量最高，在鹽脅迫后，5個(gè)ZmPDI基因表達(dá)量均有不同程度上調(diào)，提示ZmPDI可能參與了溝葉結(jié)縷草耐鹽調(diào)控，為進(jìn)一步解析蛋白二硫鍵異構(gòu)酶調(diào)控植物耐鹽性的分子機(jī)制提供了重要參考。