陳懂懂, 李 奇, 陳 昕,3, 賀福全,3, 趙新全, 徐世曉, 趙 亮

(1. 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧810008； 2. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧810008； 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京100049)

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境變化過(guò)程中具有極為顯著的作用[1]，其能調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量流動(dòng)[2-3]，同時(shí)又受到植被、土壤理化特性等生物和非生物因素直接或間接的影響[4-5]。土壤環(huán)境是各種植物賴(lài)以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，土壤微生物作為土壤環(huán)境組分的關(guān)鍵部分，對(duì)干擾和環(huán)境變化很敏感[6]，被認(rèn)為是土壤質(zhì)量的指示因子[7]。在各種生態(tài)驅(qū)動(dòng)因子中，微生物及其微生物量(soil microbial biomass,SMB)庫(kù)被認(rèn)為是控制生態(tài)系統(tǒng)功能的重要生態(tài)驅(qū)動(dòng)力，是土壤擾動(dòng)的敏感生物指標(biāo)[8]。微生物熵是指微生物生物量碳、氮等在土壤有機(jī)碳以及總氮等中所占的比例[9]，表明了土壤碳氮與土壤微生物相關(guān)以及被利用的程度[10]。作為評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[11-12]，土壤微生物功能多樣性比物種多樣性的評(píng)價(jià)更容易操作，并且直接與土壤功能相關(guān)[13]。以BIOLOG微孔板碳源代謝為基礎(chǔ)的定量分析為研究土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性提供了一種更為簡(jiǎn)單和快速的方法，被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)不同土地利用方式、不同土壤類(lèi)型以及不同植被類(lèi)型下的土壤微生物功能多樣性[11-12,14]。對(duì)土地利用方式的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，從自然生態(tài)系統(tǒng)向耕地的轉(zhuǎn)變顯著降低了微生物生物量[15]，也有研究認(rèn)為農(nóng)田土壤施肥促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng)發(fā)育[16]。

同德縣位于青海省東南腹地，地處三州(海南州、果洛州、黃南州)五縣(瑪沁縣、河南縣、澤庫(kù)縣、貴南縣、興?？h)交接處，是三江源重要的農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)[17-18]。該區(qū)自2002年開(kāi)展了大規(guī)模的草地生態(tài)建設(shè)，并將人工種草及草地改良作為一項(xiàng)基本措施，長(zhǎng)期以來(lái)，青海草原工作者的工作多集中在基于適應(yīng)性強(qiáng)、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草品種的篩選、馴化等研究，并培育出一些適應(yīng)高寒氣候的牧草品種[19-21]。對(duì)不同混播方式的研究多集中于產(chǎn)量以及生產(chǎn)性能方面[22]，而關(guān)于牧草種植對(duì)土壤質(zhì)量的影響方面研究較少[23]，。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)高寒區(qū)一年生牧草進(jìn)行單播及不同混播處理，并測(cè)定耕層0～20 cm土壤養(yǎng)分以及微生物生物量碳(microbial biomass carbon,MBC)、微生物量氮(microbial biomass nitrogen,MBN)和群落碳代謝功能，評(píng)價(jià)不同處理對(duì)土壤質(zhì)量的影響，為農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)的土壤改良提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地設(shè)在青海省海南州農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，實(shí)驗(yàn)在同德縣縣城以東5公里處的同德牧場(chǎng)進(jìn)行。地理坐標(biāo)34°38′～35°39′ N,100°08′～101°98′ E，位于青藏高原東部，平均海拔3 700 m。屬大陸高原性氣候，年日照時(shí)數(shù)2 550～2 760 h，年均溫-3.7～-6.1℃，年降水427.2 mm，多集中于6—9月，雨熱同季，冷暖兩季分明。全縣草地面積47.16萬(wàn)hm2，草地類(lèi)型主要為高寒草甸、高寒草地、山地干草原[24]。土壤以暗栗鈣土為主。牧場(chǎng)試驗(yàn)地多用于優(yōu)質(zhì)牧草選育等工作[23]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣

選取同德牧場(chǎng)5 m × 5 m的小區(qū)40個(gè)，相鄰小區(qū)之間間隔50 cm。于2016年5月播種，選取當(dāng)?shù)爻Ｒ?jiàn)種，即小黑麥(Triticalerimpau)、燕麥(AvenasativaL.)和箭筈豌豆(ViciasativaL.)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照表1組合，設(shè)置10個(gè)處理，在小區(qū)內(nèi)行播，行間距30 cm，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，完全隨機(jī)排列。每種的單株播種比例決定組合是單優(yōu)勢(shì)種，雙優(yōu)勢(shì)種或者是均勻混播。

在播種之前整個(gè)小區(qū)內(nèi)土壤是勻質(zhì)的，種植期間施肥量均一致(在播種前于每個(gè)小區(qū)采集1個(gè)樣品，每4個(gè)混為1個(gè)混合樣，共10個(gè)混合樣，測(cè)定土壤背景值)。施肥為磷酸二胺[(NH4)2HPO4]和尿素(CH4N2O)，小區(qū)(面積為25 m2)施肥量分別為281.11 g和112.44 g，頻率為1年1次，時(shí)間為播種之前。播種之前的土壤背景值為土壤有機(jī)質(zhì)(soil organic matter,SOM)：39.87±5.32 g·kg-1，全氮(soil total nitrogen,TN)：2.39±0.22 g·kg-1，土壤無(wú)機(jī)氮(soil inorganic N,Ninorg)：47.05±12.30 mg·kg-1，土壤無(wú)機(jī)碳(soil inorganic C,SIC)：11.66±1.48 g·kg-1，碳氮比(C/N)：9.67±0.93，pH值：7.78±0.04。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The design of experiments

注：處理從1到10依次為小黑麥單播，燕麥單播，箭筈豌豆單播，3∶1∶1(小黑麥單優(yōu)勢(shì)種混播)，1∶3∶1(燕麥單優(yōu)勢(shì)種混播)，1∶1∶3(箭筈豌豆單優(yōu)勢(shì)種混播)，2∶2∶1(小黑麥+燕麥雙優(yōu)勢(shì)種混播)，2∶1∶2(小黑麥+箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種混播)，1∶2∶2(燕麥+箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種混播)，1∶1∶1(三種均勻混播)，下同。

Notes:Orders From 1 to 10 are Triticale,Oats,ViciaSativa,3∶1∶1,1∶3∶1,1∶1∶3,2∶2∶1,2∶1∶2,1∶2∶2,and 1∶1∶1,respectively. The same as below.

1.3 樣品采集及測(cè)定

于2016年10月15日，采集耕層0～20 cm深度土壤樣品。在每個(gè)小區(qū)用5 cm土鉆隨機(jī)采集3點(diǎn)，組成一個(gè)混合樣，共40個(gè)混合樣。所有樣品立即帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)2 mm篩，去除根及其他雜物后，分成2部分。一部分風(fēng)干，保留一部分進(jìn)行土壤pH測(cè)定，另一部分過(guò)0.15 mm篩，用于土壤養(yǎng)分等測(cè)定；一部分4℃冰箱內(nèi)保鮮保存，用于土壤可浸提碳氮，土壤無(wú)機(jī)氮(Ninorg，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之和)，微生物量碳、氮(MBC，MBN)及群落功能測(cè)定。

土壤有機(jī)碳(soil organic C,SOC)用硫酸-重鉻酸鉀氧化法；土壤全氮(TN)采用凱氏定氮法；土壤無(wú)機(jī)碳(SIC)用碳酸測(cè)定儀測(cè)定；土壤含水量采用烘干法；pH值用PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定[25]。Ninorg用氯化鉀(KCl，2 mol·L-1)浸提后，用荷蘭Skalar San++連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定，通過(guò)可浸提土壤全氮(total dissolved N,TDN)減去Ninorg可得土壤可浸提有機(jī)氮(dissolved organic N,DON)；土壤MBC，MBN采用氯仿熏蒸浸提法，其中未熏蒸對(duì)照樣品中浸提出的C、N視為土壤可浸提有機(jī)碳(dissolved organic C,DOC)和TDN[26]。

土壤微生物群落功能多樣性采用BIOLOG法，取4℃保存土壤10 g，加90 ml滅菌生理鹽水(0.85%)在搖床上振蕩60 min，然后將土壤樣品稀釋100倍，再?gòu)闹腥?50 μL該懸浮液接種到BIOLOG微平板中的每一個(gè)孔中，最后將接種好的板置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h在BIOLOG讀數(shù)儀上讀數(shù)[27]。每個(gè)有培養(yǎng)基孔的顏色變化通過(guò)每隔24 h，在590 nm(顯色+濁度)和750 nm(濁度)波長(zhǎng)下記錄的光密度(OD)值表示[27-28]。通過(guò)減去對(duì)照來(lái)校正每個(gè)孔的吸光度值。每個(gè)孔的最終值是590 nm值減去750 nm值。負(fù)讀數(shù)設(shè)為零[28]。每個(gè)微平板中的微生物活性用AWCD值表示[29]。此處選擇72 h的光密度值來(lái)計(jì)算底物碳源多樣性[30]，OD值<0.25定義為零[31]。

根據(jù)化學(xué)性質(zhì)相似的底物組合(碳源)，可將31種碳源歸為6類(lèi)：即氨基酸類(lèi)(6種)、胺類(lèi)(2種)、碳水化合物(10種)、羧酸類(lèi)(7種)、酚類(lèi)化合物(2種)、聚合物類(lèi)(4種)[32]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Biolog數(shù)據(jù)主要包括：AWCD和Shannon- Wiener多樣性指數(shù)(H′)[31]。

平均每孔顏色變化率(average well color development,AWCD)計(jì)算[25]：

AWCD=∑ODi/31

式中：ODi為每個(gè)培養(yǎng)基矯正后的光密度值，31為培養(yǎng)基數(shù)。

其中，ODi為每類(lèi)別中底物的校正OD值，N為每類(lèi)別中底物的數(shù)量[28]。

多樣性通過(guò)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)來(lái)估測(cè)[30]:

H'=-∑pi(lnpi)

其中pi是第i種底物AWCD占所有底物AWCD的比率。

所有統(tǒng)計(jì)分析都在SPSS 16.0 中進(jìn)行。測(cè)定指標(biāo)(包括土壤容重，pH，SOC，TN，SIC，Ninorg等理化性質(zhì)，以及MBC，MBN，DOC，DON及碳代謝多樣性及AWCD值等)均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；LSD檢驗(yàn)分析在P<0.05比較平均值(若方差不齊，則采用Tamhane’s檢驗(yàn))。用層序聚類(lèi)分析(Hierachical Cluster Analysis)中的平均距離法分析處理之間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)

如表2所示，不同處理下土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)差異不顯著。盡管如此，與播種前相比，土壤SOC含量除箭筈豌豆單播組和小黑麥單優(yōu)勢(shì)種混播組外，均有不同程度增加。與播種前相比，多數(shù)處理組SIC有稍微下降。三個(gè)雙優(yōu)處理組(小黑麥+燕麥、小黑麥+箭筈豌豆以及燕麥+箭筈豌豆雙優(yōu))的土壤TN稍有增加。與種植前相比，多數(shù)處理下土壤C/N增加，土壤Ninorg顯著下降。

表2 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)Table 2 Soil basic physiochemical properties

2.2 土壤微生物量和微生物熵

小黑麥單播方式下，MBC和MBC/SOC%顯著高于箭筈豌豆單播組(P<0.05)以及箭筈豌豆與燕麥雙優(yōu)處理組(P<0.05)，同時(shí)也高于其他處理組，但差異不顯著。而雖然MBN，MBN/TN%在所有處理間不存在顯著差異，小黑麥單播和三種牧草均勻混播處理的兩個(gè)指標(biāo)比其他處理略高(表3)。

表3 土壤微生物生物量及碳代謝特征Table 3 Soil microbial biomass and C metabolism characteristics

注:同列中不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著(P<0.05)

Note:different letters indicate significant difference at the 0.05 level.

2.3 不同處理下的土壤微生物對(duì)碳源的利用

BIOLOG試驗(yàn)結(jié)果(AWCD)顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理下的土壤微生物群落對(duì)碳源利用程度均逐漸增大，到192 h基本趨于平穩(wěn)(圖1)。且各處理下土壤微生物對(duì)碳源利用多樣性(H′)及代謝強(qiáng)度(AWCD)均差異不顯著，只有燕麥和箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種混播處理下的AWCD值稍低于其他處理組(表3)。所有處理下的土壤微生物主要利用碳源類(lèi)型為羧酸類(lèi)、酚類(lèi)化合物、碳水化合物和氨基酸，對(duì)胺類(lèi)和復(fù)合物類(lèi)的利用程度相對(duì)較低(圖2)。

圖1 不同處理下土壤微生物群落對(duì)總碳源的利用強(qiáng)度變化Fig.1 Utilization intensity of soil microbial communities to total carbon sources under different treatments

圖2 不同處理下土壤微生物群落對(duì)六類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度Fig.2 Utilization intensity of soil microbial communities to six types of carbon sources under different treatments

2.4 聚類(lèi)分析

從聚類(lèi)分析看，根據(jù)土壤微生物特性(表3)，把所有處理分成2大類(lèi)，其中小黑麥單播和種植燕麥單優(yōu)勢(shì)種(1∶3∶1)、箭筈豌豆單優(yōu)勢(shì)種(1∶1∶3)以及小黑麥+燕麥雙優(yōu)勢(shì)種(2∶2∶1)，對(duì)土壤微生物特性的影響相似，微生物活性大于其他處理。而將草產(chǎn)量(表1)考慮進(jìn)去之后，箭筈豌豆單播處理下生產(chǎn)特性遠(yuǎn)低于其他處理，故綜合考慮土壤微生物活性和生產(chǎn)特性，在實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)中不適宜箭筈豌豆單播。

圖3 聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of soil microbial factors under different treatments注：case 1-小黑麥單播；case 2-燕麥單播；case 3-箭筈豌豆單播；case 4-3∶1∶1；case 5-1∶3∶1；case 6-1∶1∶3；case 7-2∶2∶1；case 8-2∶1∶2；case 9-1∶2∶2；case 10-1∶1∶1Note:case 1-Triticale,case 2-Oats,case 3-Vicia sativa,case 4-3∶1∶1,case 5-1∶3∶1,case 6-1∶1∶3,case 7-2∶2∶1,case 8-2∶1∶2,case 9-1∶2∶2,case 10-1∶1∶1

3 討論

3.1 不同混播處理下的土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)

與種植前相比，各混播處理下土壤容重和pH并無(wú)明顯差異，可能由于耕作制度的進(jìn)行導(dǎo)致整個(gè)區(qū)域土壤容重值和pH偏高[33]。與播種前相比，土壤SOC含量除箭筈豌豆單播和小黑麥單優(yōu)勢(shì)種混播外，均有不同程度增加，其中以燕麥和箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種混播處理下增加最多(6.44%)，這與該處理下土壤微生物活性相對(duì)較弱相呼應(yīng)(表3)。雖然與播種前相比，多數(shù)處理下SIC有稍微下降，但與其它地區(qū)相比[30-32]，研究區(qū)有相對(duì)較高的SIC含量，可能是因?yàn)樵搮^(qū)土壤的干旱和較高的pH[33,37]。多數(shù)處理下土壤C/N的增加，表明研究區(qū)土壤有機(jī)碳存在固持的潛力[34]。與種植前相比，土壤Ninorg顯著降低，表明種植區(qū)植物對(duì)氮的利用強(qiáng)度較大或者該研究區(qū)存在氮素限制[23]。

3.2 不同混播處理下的土壤微生物量和微生物熵

微生物量被認(rèn)為是一種比土壤有機(jī)質(zhì)更為靈敏的評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的指標(biāo)，土壤微生物量與土壤養(yǎng)分關(guān)系密切，是反映土壤生物學(xué)質(zhì)量變化的重要指標(biāo)，其含量高低反映周轉(zhuǎn)速率[39]。小黑麥單播方式下，MBC、MBC/SOC%高于其他混播處理，說(shuō)明單播小黑麥的土壤中微生物對(duì)碳的利用強(qiáng)度較大，碳周轉(zhuǎn)速率相對(duì)較高。在所有處理下，MBC/SOC%和MBN/TN%變化范圍分別為1.56%～2.09%和4.20%～5.31%，表明區(qū)域內(nèi)土壤微生物對(duì)氮的利用強(qiáng)于對(duì)碳的利用[10]。Liu等認(rèn)為MBC比MBN和微生物生物量磷(MBP)更易于分析，使其成為未來(lái)其他實(shí)用分析的潛在工具[40]，而我們的結(jié)果也顯示，在一年生牧草混播處理實(shí)驗(yàn)中，MBC比MBN更加敏感。

3.3 不同處理下的土壤微生物對(duì)碳源的利用

土壤微生物在BIOLOG微平板上的AWCD值是反映土壤微生物活性，即對(duì)碳源利用能力的一個(gè)重要指標(biāo)，其值越大說(shuō)明微生物對(duì)碳源的代謝能力越強(qiáng)[27,30]。研究土壤微生物群落對(duì)不同碳源利用能力的差異，有助于全面了解微生物群落代謝功能特征。BIOLOG試驗(yàn)結(jié)果(AWCD)顯示，不同混播處理下的土壤微生物群落對(duì)總碳源代謝強(qiáng)度差異不顯著，表明研究區(qū)的土壤微生物群落存在相似的碳源利用潛力，這可能與土壤中類(lèi)似的根系分泌物有關(guān)[14]，也可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)期(1年)較短，微生物群落組成短期內(nèi)還未發(fā)生較大變化。

根據(jù)化學(xué)性質(zhì)相似的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)底物碳源進(jìn)行組合后分析[31]，發(fā)現(xiàn)不同處理下土壤微生物主要利用羧酸類(lèi)、酚類(lèi)化合物、碳水化合物和氨基酸，對(duì)胺類(lèi)和復(fù)合物類(lèi)的利用程度相對(duì)較低，明顯區(qū)別于高寒區(qū)其他天然草地[14]。而培養(yǎng)基多樣性指數(shù)(H')表明的是土壤微生物群落利用碳源類(lèi)型的多與少，即功能多樣性[11]。研究表明，燕麥和箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種的組合中，土壤微生物對(duì)碳源利用類(lèi)型較少，利用強(qiáng)度偏低，但與其他混播或者單播處理差異不顯著。以上結(jié)果表明，研究區(qū)域在不同混播處理下，土壤微生物對(duì)碳的利用強(qiáng)度和利用類(lèi)型相似。

4 結(jié)論

單播小黑麥的土壤中微生物對(duì)碳的利用強(qiáng)度較大，碳周轉(zhuǎn)速率相對(duì)較高，從另一方面講，小黑麥單播可能會(huì)促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解；而燕麥和箭筈豌豆雙優(yōu)勢(shì)種混播有增加土壤有機(jī)質(zhì)的潛力；土壤微生物對(duì)氮的利用強(qiáng)于對(duì)碳的利用，作為土壤質(zhì)量的指示因子，MBC比MBN更加敏感；研究區(qū)域不同處理下，土壤微生物對(duì)碳源的利用強(qiáng)度和利用類(lèi)型均相似；進(jìn)行小黑麥單播和種植燕麥單優(yōu)勢(shì)種、箭筈豌豆單優(yōu)勢(shì)種以及小黑麥+燕麥雙優(yōu)勢(shì)種，對(duì)土壤微生物特性的影響相似，其微生物活性大于其他處理。綜合考慮土壤微生物活性和生產(chǎn)特性，在實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)中不適宜箭筈豌豆單播。