康冬柳 ，邢江峰 ，胡愛明 ，張付華 ，徐俊杰 ，文明華

（1.吉安市畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343000；2.北京一立科技公司；3.九江市畜牧獸醫(yī)局；4.南昌市動物疫病預(yù)防控制中心；5.宜春市畜牧水產(chǎn)局；）

目前市級以下動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)由于設(shè)備、人員的缺乏，技術(shù)水平較低，造成多數(shù)動物疫病在基層不能及時檢測和診斷，有些疫病或樣本在基層無法開展病原學(xué)檢測，從而造成動物疫病的處置延遲和病原擴(kuò)散，給養(yǎng)殖業(yè)造成損失甚至發(fā)生人畜共患病。因此，如何快速診斷動物疫病、“早快嚴(yán)小”控制動物疫情成為我們亟需解決的關(guān)鍵問題。

借鑒國內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)，我們探索建立了一套針對基層動物疫病檢測診斷的技術(shù)手段和解決方案，開發(fā)研究適合基層動物疫病檢驗診斷的技術(shù)平臺。技術(shù)平臺可根據(jù)具體地區(qū)研發(fā)不同疫病、項目的檢測試劑盒，簡化操作步驟和設(shè)備，靈敏度和操作性比現(xiàn)有試劑更優(yōu)。從而實現(xiàn)只需有PCR儀及常見設(shè)備、耗材，就能在市級以下動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)甚至養(yǎng)殖場、流動診斷車上都能開展病原學(xué)檢測的動物疫病診斷新局面。同時由于優(yōu)化了檢測方法，減少了操作步驟，具有實驗操作水平的工作人員可直接使用，或者沒有操作水平的工作人員可在極短期的培訓(xùn)后可直接上崗，解決了實驗室專業(yè)人員不足的困難。

1 技術(shù)平臺簡介

隨著分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)也得到了越來越廣泛的應(yīng)用。在遺傳病檢測、個體化用藥檢測、病原體檢測等領(lǐng)域qPCR技術(shù)已經(jīng)成為不可或缺的基本技術(shù)?，F(xiàn)在傳統(tǒng)的檢測方法是使用柱提法或磁珠法先從檢測樣本中將核酸提取出來，然后將提取好的核酸加入到配置好的PCR反應(yīng)液里，這種傳統(tǒng)的熒光PCR方法需要人工干預(yù)的步驟較多，而且對實驗室的要求也高，整個反應(yīng)流程需要4～6h。

我們建立的直擴(kuò)qPCR技術(shù)平臺（POCT qPCR），使用1st TECH核酸定向釋放劑10min即可完成樣本中DNA和RNA的釋放，同時可將樣本中干擾qPCR反應(yīng)效率的物質(zhì)凝固；釋放后的核酸樣本可以直接加入PCR反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)，將qPCR檢測縮短至60min左右。

同時我們還建立了一種即用型qPCR的反應(yīng)體系，省去了配置PCR反應(yīng)液的實驗過程，與1st TECH核酸定向釋放劑配合使用可以使qPCR反應(yīng)操作更簡單。

2 技術(shù)平臺優(yōu)勢

核酸提取方法和傳統(tǒng)的核酸提取方法的比較：

3 應(yīng)用

3.1 我們將該技術(shù)平臺初步應(yīng)用于動物H7N9的病原學(xué)監(jiān)測和篩查，完成監(jiān)測任務(wù)5 000余份次，具有設(shè)備簡化、步驟簡單、操作方便、靈敏度高等特點(diǎn)，非常適合市級以下基層動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)用。

3.2 該技術(shù)平臺可用于多種類型樣本的檢測

①血液樣本：全血樣本、血清、血漿、指尖血；

②分泌物樣本：口腔拭子、咽拭子、肛拭子、生殖道分泌物或拭子、動物咽拭子；

③組織或細(xì)胞樣本：組織研磨上清液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)菌或病毒培養(yǎng)物。

3.3 可根據(jù)具體地區(qū)、具體病種繼續(xù)研發(fā)不同疫病、項目的檢測試劑盒。

3.4 可用于樣本中RNA和DNA的檢測，國內(nèi)同類產(chǎn)品只能進(jìn)行DNA的檢測。我們可以將傳統(tǒng)qPCR的檢測時間縮短至少1h以上，尤其適合于動物疫病的快速篩查，在最短的時間內(nèi)就可以將結(jié)果上報，為正確的處理疫情贏得了時間。