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        基層動(dòng)物疫病快速檢測(cè)診斷技術(shù)平臺(tái)的建立及應(yīng)用

        2018-11-07 09:00:40康冬柳邢江峰胡愛(ài)明張付華徐俊杰文明華
        江西畜牧獸醫(yī)雜志 2018年5期
        關(guān)鍵詞:病原學(xué)核酸疫病

        康冬柳 ,邢江峰 ,胡愛(ài)明 ,張付華 ,徐俊杰 ,文明華

        (1.吉安市畜牧獸醫(yī)局,江西 吉安 343000;2.北京一立科技公司;3.九江市畜牧獸醫(yī)局;4.南昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心;5.宜春市畜牧水產(chǎn)局;)

        目前市級(jí)以下動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)由于設(shè)備、人員的缺乏,技術(shù)水平較低,造成多數(shù)動(dòng)物疫病在基層不能及時(shí)檢測(cè)和診斷,有些疫病或樣本在基層無(wú)法開(kāi)展病原學(xué)檢測(cè),從而造成動(dòng)物疫病的處置延遲和病原擴(kuò)散,給養(yǎng)殖業(yè)造成損失甚至發(fā)生人畜共患病。因此,如何快速診斷動(dòng)物疫病、“早快嚴(yán)小”控制動(dòng)物疫情成為我們亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

        借鑒國(guó)內(nèi)外先進(jìn)技術(shù),我們探索建立了一套針對(duì)基層動(dòng)物疫病檢測(cè)診斷的技術(shù)手段和解決方案,開(kāi)發(fā)研究適合基層動(dòng)物疫病檢驗(yàn)診斷的技術(shù)平臺(tái)。技術(shù)平臺(tái)可根據(jù)具體地區(qū)研發(fā)不同疫病、項(xiàng)目的檢測(cè)試劑盒,簡(jiǎn)化操作步驟和設(shè)備,靈敏度和操作性比現(xiàn)有試劑更優(yōu)。從而實(shí)現(xiàn)只需有PCR儀及常見(jiàn)設(shè)備、耗材,就能在市級(jí)以下動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)甚至養(yǎng)殖場(chǎng)、流動(dòng)診斷車上都能開(kāi)展病原學(xué)檢測(cè)的動(dòng)物疫病診斷新局面。同時(shí)由于優(yōu)化了檢測(cè)方法,減少了操作步驟,具有實(shí)驗(yàn)操作水平的工作人員可直接使用,或者沒(méi)有操作水平的工作人員可在極短期的培訓(xùn)后可直接上崗,解決了實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員不足的困難。

        1 技術(shù)平臺(tái)簡(jiǎn)介

        隨著分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)也得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。在遺傳病檢測(cè)、個(gè)體化用藥檢測(cè)、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域qPCR技術(shù)已經(jīng)成為不可或缺的基本技術(shù)?,F(xiàn)在傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是使用柱提法或磁珠法先從檢測(cè)樣本中將核酸提取出來(lái),然后將提取好的核酸加入到配置好的PCR反應(yīng)液里,這種傳統(tǒng)的熒光PCR方法需要人工干預(yù)的步驟較多,而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也高,整個(gè)反應(yīng)流程需要4~6h。

        我們建立的直擴(kuò)qPCR技術(shù)平臺(tái)(POCT qPCR),使用1st TECH核酸定向釋放劑10min即可完成樣本中DNA和RNA的釋放,同時(shí)可將樣本中干擾qPCR反應(yīng)效率的物質(zhì)凝固;釋放后的核酸樣本可以直接加入PCR反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng),將qPCR檢測(cè)縮短至60min左右。

        同時(shí)我們還建立了一種即用型qPCR的反應(yīng)體系,省去了配置PCR反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,與1st TECH核酸定向釋放劑配合使用可以使qPCR反應(yīng)操作更簡(jiǎn)單。

        2 技術(shù)平臺(tái)優(yōu)勢(shì)

        核酸提取方法和傳統(tǒng)的核酸提取方法的比較:

        3 應(yīng)用

        3.1 我們將該技術(shù)平臺(tái)初步應(yīng)用于動(dòng)物H7N9的病原學(xué)監(jiān)測(cè)和篩查,完成監(jiān)測(cè)任務(wù)5 000余份次,具有設(shè)備簡(jiǎn)化、步驟簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高等特點(diǎn),非常適合市級(jí)以下基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)用。

        3.2 該技術(shù)平臺(tái)可用于多種類型樣本的檢測(cè)

        ①血液樣本:全血樣本、血清、血漿、指尖血;

        ②分泌物樣本:口腔拭子、咽拭子、肛拭子、生殖道分泌物或拭子、動(dòng)物咽拭子;

        ③組織或細(xì)胞樣本:組織研磨上清液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)菌或病毒培養(yǎng)物。

        3.3 可根據(jù)具體地區(qū)、具體病種繼續(xù)研發(fā)不同疫病、項(xiàng)目的檢測(cè)試劑盒。

        3.4 可用于樣本中RNA和DNA的檢測(cè),國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品只能進(jìn)行DNA的檢測(cè)。我們可以將傳統(tǒng)qPCR的檢測(cè)時(shí)間縮短至少1h以上,尤其適合于動(dòng)物疫病的快速篩查,在最短的時(shí)間內(nèi)就可以將結(jié)果上報(bào),為正確的處理疫情贏得了時(shí)間。

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