龔 劍， 林粲源， 熊小萍， 陳迪云， 陳永亨， 吳翠琴

(廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，珠江三角洲水質(zhì)安全與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省放射性核素污染控制與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

皮質(zhì)激素通常分為糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)和鹽皮質(zhì)激素(mineral ocorticoids，MCs)，是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一類類固醇激素，被廣泛用于各種炎癥和免疫疾病治療和預(yù)防［1，2］。由于具有較高的環(huán)境內(nèi)分泌干擾活性，近年來受到了國際社會的廣泛關(guān)注。環(huán)境中皮質(zhì)激素的來源主要包括:由人類和動物的排泄進(jìn)入污水系統(tǒng)，經(jīng)過污水處理廠不完全處理后排放;或者通過人類農(nóng)業(yè)或畜牧業(yè)活動的直接排放［3－5］。進(jìn)入環(huán)境中的皮質(zhì)激素會導(dǎo)致地表水污染，進(jìn)而危及生態(tài)系統(tǒng)和人類健康［6］。

近年來，針對環(huán)境樣品中皮質(zhì)激素的分析方法才逐步發(fā)展起來，主要采用選擇性好、操作相對簡便的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［1，7－9］。但目前該類方法覆蓋的目標(biāo)物范圍較小，主要集中在氫化可的松、地塞米松、潑尼松等少數(shù)幾種最常見的糖皮質(zhì)激素，對鹽皮質(zhì)激素則關(guān)注較少［4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，市政污水中常有較高濃度的糖皮質(zhì)激素被檢出，而天然地表水中的檢出率則較低［4，9，10］?？紤]到生產(chǎn)生活中使用的皮質(zhì)激素種類繁多，并且它們在極低的質(zhì)量濃度水平(ng/L)下就可能對人類和生態(tài)環(huán)境造成不利影響［6］，因此有必要建立一種高效、靈敏且能同時(shí)測定多種糖/鹽皮質(zhì)激素的痕量分析方法，以便對水環(huán)境中這類內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行全面、有效的監(jiān)控。

本研究采用固相萃取(SPE)富集水樣，聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種同時(shí)測定地表水中25種糖皮質(zhì)激素和3種鹽皮質(zhì)激素的痕量分析方法，并應(yīng)用于珠江三角洲河流水樣的檢測。該方法實(shí)現(xiàn)了對大部分常見常用的天然和人工合成皮質(zhì)激素的同時(shí)快速檢測，具有選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠?yàn)樗h(huán)境中皮質(zhì)激素的監(jiān)測、行為研究及風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

1260 Infinity-6460 QQQ超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(UHPLC-MS/MS，Agilent公司)，配有電噴霧離子(ESI)源，Agilent MassHunter定量分析軟件;SPE固相萃取裝置(Supelco公司)，Oasis HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，Waters公司)，玻璃纖維濾膜(GF/F，0.7 μm，Whatman公司);甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，Merck公司)，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)。28種皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品(見表1)均購自Sigma-Aldrich公司，純度均大于98%。5種同位素標(biāo)準(zhǔn)品:氫化可的松-d4、地塞米松-d4、曲安奈德-13C3、布地奈德-d8、丙酸氟替卡松-d5均購自Toronto Research Chemicals公司，純度均大于95%。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成質(zhì)量濃度為10 mg/L的28種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和10 mg/L的5種同位素替代物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液;再將28種目標(biāo)物的混合儲備液逐級稀釋成質(zhì)量濃度范圍為1.0～100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將5種同位素替代物儲備液稀釋成1 mg/L備用。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于－20℃避光儲存。

1．2 樣品的采集與處理

利用手持式采樣泵采集河流表層水(水深0～0.5 m)，置于干凈棕色瓶中并加入適量的疊氮化鈉(水樣中的質(zhì)量濃度約200 mg/L)，避免微生物降解。樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即用玻璃纖維濾膜過濾，收集濾液并置于冰柜4℃避光保存。

樣品富集:先后用6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈和12 mL超純水活化固相萃取柱。向1 L濾液加入適量的同位素替代物，混合標(biāo)樣后以8～10 mL/min的流速過柱。上樣完畢后，用10 mL 10%(v/v)乙腈/水溶液淋洗萃取柱，然后真空干燥2 h，除盡柱床中的水分。隨后依次用6 mL乙酸乙酯/乙腈(1∶1，v/v)、6 mL乙酸乙酯洗脫，收集、合并洗脫液，用高純氮?dú)獯抵羷偢?，再用甲醇定容?.5 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，待UHPLC-MS/MS分析。

1．3UHPLC-MS/MS 分析

液相色譜條件:色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8(100 mm×3.0 mm，1.8 μm);流動相A為0.1%(v/v)乙酸，流動相B為乙腈;流速0.3 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量3 μL。梯度洗脫程序如表2所示。

表1 28種目標(biāo)化合物及其多反應(yīng)監(jiān)測中的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Twenty-eight target compounds and their mass spectrometric parameters in MRM transition

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表2 超高效液相色譜梯度洗脫條件Table 2 UHPLC gradient elution program

質(zhì)譜條件:ESI源，正負(fù)離子掃描模式(ESI±)，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dynamic multiple reaction monitoring，DMRM)模式，霧化器壓力為276 kPa(40 psi)，干燥氣體流速為11 L/min，離子源溫度為300℃，毛細(xì)管電壓為4 000 V。各物質(zhì)離子對優(yōu)化后參數(shù)及其保留時(shí)間見表1，總離子色譜圖見圖1。

圖1 50 μg/L的28種目標(biāo)物總離子色譜圖Fig．1 Total ion chromatogram of 28 target compounds at 50 μg/L

定量分析:為了有效監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程的系統(tǒng)誤差，消減基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量。使用5種同位素替代物作為內(nèi)標(biāo)對28種目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，其相互間的對應(yīng)關(guān)系(見表1)為(括號中為目標(biāo)物編號):氫化可的松-d4(No．1～6)、地塞米松-d4(No．7～12)、曲安奈德-13C3(No．13～18)、布地奈德-d8(No．19～22)、丙酸氟替卡松-d5(No．23～28)。

2 結(jié)果與討論

2．1 固相萃取洗脫液的選擇

皮質(zhì)激素具有中弱極性，使用乙酸乙酯或其混合有機(jī)溶劑作為SPE洗脫液常常能得到較好的洗脫效率［4，9，11，12］?？紤]到本研究中目標(biāo)物較多、極性范圍較大，除了選取12 mL乙酸乙酯(EtAc)和乙酸乙酯/乙腈(EtAc-ACN)(1∶1，v/v)外，亦將乙酸乙酯/乙腈(1∶1，v/v)+乙酸乙酯(EtAc-ACN+EtAc)(6 mL+6 mL)作為洗脫劑進(jìn)行比較。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)使用乙酸乙酯/乙腈+乙酸乙酯洗脫時(shí)，28種目標(biāo)化合物的回收率普遍較高，標(biāo)準(zhǔn)偏差相對較低。

2．2 液相條件的優(yōu)化

皮質(zhì)激素類化合物結(jié)構(gòu)相似，因此將其在色譜柱上完全分離存在一定的難度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在目標(biāo)物較多的情況下，采用甲醇體系時(shí)各化合物無法完全分離，有共流出現(xiàn)象，信號相互干擾增強(qiáng)［13］。相較而言，使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，28種目標(biāo)物的分離效果較好，響應(yīng)值與使用甲醇時(shí)相比，普遍相當(dāng)或略低。因此最終采用了乙腈/水流動相體系分離分析目標(biāo)物。此外，比較了甲酸、乙酸這兩種常用的離子化添加劑的效果。發(fā)現(xiàn)使用乙酸時(shí)，目標(biāo)物的信號強(qiáng)度普遍較使用甲酸時(shí)高，故選用0.1%(v/v)的乙酸水溶液作為水相。

圖2 洗脫液對回收率的影響Fig．2 Effect of eluting solvent on recoveries

C18反相色譜柱常用于多種類固醇激素的同時(shí)測定，目前已報(bào)道的方法幾乎都采用C18色譜柱［14］。但是，在專門針對數(shù)十種且部分含有同分異構(gòu)體的皮質(zhì)激素的分離分析時(shí)，由于C18柱具有較強(qiáng)的保留性而分離效果不甚理想，尤其是對結(jié)構(gòu)極為相似的差向異構(gòu)體。例如，無論以甲醇還是乙腈作流動相，在常用的C18反相色譜柱(Agilent Poroshell 120 EC C18，100 mm×4.6 mm，2.7 μm)上，倍他米松和地塞米松兩種差向異構(gòu)體的信號發(fā)生重疊，不易分開，難以定性。采用保留性較弱的C8反相色譜柱(Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8，100 mm ×3.0 mm，1.8 μm)分離上述差向異構(gòu)體，取得了良好的分離效果且峰形佳。此外，通過梯度淋洗條件進(jìn)行了優(yōu)化，對所有目標(biāo)物分離效果良好，出峰時(shí)間較為合適(見表1)。

2．3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在ESI正、負(fù)離子掃描模式下對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行全掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn):15種目標(biāo)物與乙酸的加合物［M+CH3COO］－是豐度最高的離子，選為母離子;13種目標(biāo)物的質(zhì)子化分子離子峰響應(yīng)最高，選［M+H］+作為母離子(見表1)。特征離子對的選取采用ESI±掃描模式，優(yōu)化碰撞能量和碎裂電壓，采用子離子掃描模式，選擇響應(yīng)最高的兩個(gè)子離子作為特征子離子(見表1)。

為了提高方法的靈敏度，本研究采用DMRM模式，即按照目標(biāo)物的保留時(shí)間設(shè)置監(jiān)測離子的掃描時(shí)間窗口，在不同時(shí)間段分別進(jìn)行MRM掃描，以增加窗口期目標(biāo)離子的掃描頻率，進(jìn)而提高信號響應(yīng)強(qiáng)度。綜合比較發(fā)現(xiàn)，設(shè)定目標(biāo)物采集時(shí)間窗口(delta retention time)為1.2 min較為合適，與常規(guī)MRM掃描結(jié)果相比，大部分目標(biāo)物的響應(yīng)有了明顯提高。

2．4 基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)

環(huán)境樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，且ESI質(zhì)譜分析通常會存在基質(zhì)效應(yīng)(ME)，影響方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性。因此本研究采用向萃取濃縮液加標(biāo)的方法對地表水樣進(jìn)行了基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)。根據(jù)公式［14］ME=(1－空白基質(zhì)溶液中目標(biāo)物的響應(yīng)值/純?nèi)軇┲邢鄳?yīng)目標(biāo)物的響應(yīng)值)×100%計(jì)算，得到28種皮質(zhì)激素的ME值(見表3)。結(jié)果表明，所有目標(biāo)物的ME值在2.6%～27.6%之間，主要呈現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。為了盡可能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本文采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2．5 方法線性方程和檢出限、定量限

在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，將配制好的1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液按質(zhì)量濃度從低到高的順序進(jìn)行測定，以選定的定量離子峰面積為Y，質(zhì)量濃度(μg/L)為X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法檢出限和定量限。如表3所示，28種目標(biāo)物在1.0～100 μg/L范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(R2＞0.99)，方法檢出限和定量限分別在 0.21～0.48 ng/L和0.32～0.72 ng/L之間，滿足實(shí)驗(yàn)室痕量分析要求。

2．6 加標(biāo)回收率與精密度

野外空白樣品和實(shí)驗(yàn)室空白樣品中所有目標(biāo)物均未檢出。取1L河水進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，在5、10、50 ng/L 3個(gè)加標(biāo)水平下，所有目標(biāo)物的平均回收率(n=5)為68.8%～108.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%(見表4)。本方法的準(zhǔn)確度與精密度能滿足環(huán)境監(jiān)測中痕量有機(jī)污染物的分析要求。

表3 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)，and matrix effects(MEs)of the target compounds

表4 地表水中28種皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table 4 Spiked recoveries and precisions of the 28 corticosteroids in surface water(n=5)

表4 (續(xù))Table 4 (Continued)

2．7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法測定了4份取自珠江三角洲河流的表層水樣，28種皮質(zhì)激素的檢測結(jié)果見表5。珠江廣州段和東江的皮質(zhì)激素檢出率較高，分別有9種目標(biāo)物被檢出;西江和北江的檢出率則較低，分別有5種目標(biāo)物被檢出。

28種目標(biāo)物中，鹽皮質(zhì)激素:醛固酮、螺旋內(nèi)酯、醋酸脫氧皮質(zhì)酮的含量在ND～3.09 ng/L之間(ND表示未檢出);糖皮質(zhì)激素:氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、皮質(zhì)酮、氟米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、安西奈德、丙酸氯倍他索、糠酸莫米他松、丙酸氟替卡松二丙酸倍氯米松的含量在ND～5.91 ng/L之間。其中檢出率較高的6種皮質(zhì)激素的MRM色譜圖如圖3所示。

表5 珠江三角洲河流表層水中的皮質(zhì)激素含量Table 5 Contents of corticosteroids in the surface water from the rivers of Pearl River Delta

圖3 實(shí)際水樣中6種皮質(zhì)激素的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig．3 MRM chromatograms of the six corticosteroids detected in real water samples

3 結(jié)論

利用SPE富集凈化技術(shù)并聯(lián)合ESI±動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測掃描方法，建立了一種UHPLC-MS/MS同時(shí)測定地表水中28種皮質(zhì)激素的痕量分析方法，實(shí)現(xiàn)了對大部分常見常用的鹽/糖皮質(zhì)激素的同時(shí)快速檢測。該方法具有選擇性好，靈敏度、精密度和回收率高等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于環(huán)境中皮質(zhì)激素的監(jiān)測、行為研究及風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)等領(lǐng)域。