楊 歡， 吳小亮， 張函彤， 何 巧， 倪妍霞， 黃思琦， 牟仁祥

(中國水稻研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，浙江杭州310006)

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)是支鏈氨基酸合成的第一種酶［1，2］，ALS抑制劑類除草劑可通過降低ALS活性，導(dǎo)致纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成受阻［3］，從而抑制雜草生長。近年來，甲基二磺隆、氯吡嘧磺、雙草醚、嘧草醚、嘧苯胺磺隆和乙氧嘧磺隆等新型ALS抑制劑類除草劑(見圖1)因其用量低［4］、毒性小、活性高被廣泛用于水稻、油菜籽等作物中闊葉雜草的防治［5－7］。但隨著雜草抗性增強和施藥量增加，此類除草劑對農(nóng)田和動物等非目標生物體構(gòu)成的潛在威脅不容小覷［8－12］。為此，歐盟、韓國和日本嚴格規(guī)定 ALS 抑制劑類除草劑在油菜籽等作物中的殘留限量為0.01～0.1 mg/kg［13，14］，但我國尚未制定 6 種 ALS抑制劑類除草劑的相關(guān)標準和檢測技術(shù)。

油料作物的基質(zhì)組成復(fù)雜，脂質(zhì)等共提物會影響提取效率和儀器檢測，對農(nóng)藥的多殘留痕量分析造成較強的基質(zhì)效應(yīng)。而目前廣泛應(yīng)用于果蔬等多種基質(zhì)分析［15－21］的 QuEChERS 方法主要吸附色素、糖類等雜質(zhì)，但對脂質(zhì)的凈化能力較弱。增強型基質(zhì)去除吸附劑(EMR)是對脂質(zhì)具有強選擇性的新型吸附劑，在除去基質(zhì)中雜質(zhì)的同時不會吸附目標化合物，適用于高脂肪含量樣品凈化［22，23］。近年來超聲波輔助提取(ultrasound-assisted extraction，USE)因其增加擴散性、減少共萃取化合物等優(yōu)點被用于樣品基質(zhì)中化合物的提?。?4，25］，但在油料作物中農(nóng)藥提取的應(yīng)用較少。

圖1 6種新型乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig．1 Chemical structures of the six novel acetolactate synthase(ALS)inhibitor herbicides

國內(nèi)外文獻報道的ALS抑制劑類除草劑分析方法有酶聯(lián)免疫法［26］、毛細管電泳法［27］、GC法［28］、GC-MS 法［29，30］、HPLC 法［31，32］、HPLC-MS法［25，33－38］等，但主要局限于水稻、玉米等谷類作物及土壤和田水［35－37，39］，系統(tǒng)研究油料作物中 6 種新型ALS類除草劑的檢測方法未見報道。本實驗采用超聲波輔助酸化乙腈溶劑提取，EMR吸附劑凈化后用LC-MS/MS測定，可實現(xiàn)6種新型ALS抑制劑類除草劑在油料作物中的多殘留分析，為油料作物中除草劑的殘留分析和科學(xué)使用提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1．1 儀器、試劑與材料

LC-20ADXR液相色譜儀配SIL-20ACXR自動進樣裝置(日本 Shimadzu公司)，AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿電子噴霧質(zhì)譜儀，Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國 SCIEX公司)，Poroshell 120 EC-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)，高速勻漿機(德國IKA公司)，臺式多用途高速離心機(美國Thermo Fisher公司)，十萬分之一天平(美國 Mettler Toledo公司)，KQ-300TDE型高頻數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲基二磺隆(純度98.5%)、氯吡嘧磺隆(純度98.0%)、雙草醚(純度 99.0%)、嘧草醚(純度99.0%)、嘧苯胺磺隆(純度98.0%)和乙氧嘧磺隆(純度 99.0%)標準品(德國 Dr．Ehrenstorfer公司);乙腈(色譜純，德國Merck公司);甲酸(色譜純，美國Fluka公司);無水硫酸鎂(分析純，Sigma-Aldrich公司);氯化鈉(分析純，上海試四赫維化工有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB)、弗羅里硅土(Florisil)填料(粒徑40.0 μm，美國瓦里安公司)和 Bond Elut EMR-Lipid EMR(美國 Agilent公司)。

1．2 標準溶液配制

用十萬分之一天平稱取各標準品10.00 mg(精確至0.01 mg)，溶于10.0 mL乙腈溶液中，分別配制成1.0 g/L的單標準儲備液，密封藏于－20℃。分別取適量單標準儲備液，置于10.0 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，配制成嘧苯胺磺隆(10.0 mg/L)、雙草醚(10.0 mg/L)、甲基二磺隆(1.0 mg/L)、乙氧嘧磺隆(1.0 mg/L)、氯吡嘧磺隆(1.0 mg/L)和嘧草醚(1.0 mg/L)的混合標準溶液備用。此外，用乙腈-水(含0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸)溶液將6種除草劑單標準儲備液依次稀釋，分別配制成100 μg/L的單標準溶液，待優(yōu)化。

1．3 樣品前處理

1．3．1 超聲提取

將油菜籽、大豆、花生米和葵花籽4種油料樣品自然晾干后用磨粉機弄成粉末，準確稱取5.0 g(精確至0.1 g)粉末樣品于離心管中，加入20.0 mL超純水充分浸泡30.0 min。加入25.0 mL乙腈(含1.0%的甲酸溶液)，置于超聲儀(25℃，40 kHz)中超聲提取10.0 min，以5 000 r/min的速度離心5.0 min，上清液待凈化。

1．3．2 QuEChERS 方法提取

準確稱取5.0 g(精確至0.1 g)1.3.1節(jié)中的粉末樣品于離心管中，加入20.0 mL超純水充分浸泡30.0 min，再加入25.0 mL乙腈(含1.0%的甲酸溶液)，勻漿1.0 min。分別加入10.0 g無水MgSO4和1.0 g NaCl，勻漿 1.0 min，以 5 000 r/min的速度離心 5.0 min，上清液待凈化［40］。

1．3．3 樣品凈化

取5.0 mL上清液加入分別含100 mg PSA、C18、GCB、Florisil、EMR 吸附劑和 1.2 g 無水MgSO4的15.0 mL凈化管中，渦旋混合器上振蕩1.0 min，以5 000 r/min的速度離心5.0 min，取上清液，過 0.22 μm 有機濾膜，濾液供 LC-MS/MS測定。

1．4 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱:Poroshell 120 EC-C18柱;柱溫:40℃，流速:0.2 mL/min，進樣量:2.0 μL;流動相由0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)組成。梯度洗脫程序為:0～12.0 min，30%B～95%B;12.0～16.0 min，95%B;16.0～16.1 min，95%B～30%B;16.1～26.0 min，30%B。電噴霧正離子模式(ESI+);離子源溫度:500℃;離子電噴霧電壓:5 500V;門簾氣壓力:139 kPa;Gas1和Gas2的壓力均為276 kPa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集，Analyst 1.6.2軟件處理系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，其余質(zhì)譜參數(shù)及離子信息見表1。

2 結(jié)果與討論

2．1 目標化合物的儀器條件優(yōu)化

實驗采用乙腈-水(含0.1%甲酸)配制各除草劑單標準溶液(100 μg/L)，6種化合物經(jīng)正離子全掃描后可得到響應(yīng)較高的分子離子峰，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下檢測各化合物的子離子。為進一步降低假陽性，確保分析方法的準確度，最終從二級質(zhì)譜掃描得到的多個特征碎片離子中選擇穩(wěn)定性好、響應(yīng)值高的3個碎片離子分別作為定量和定性離子，具體質(zhì)譜條件及分析物采集參數(shù)見表1。

表1 6種新型ALS抑制類除草劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of the six novel ALS inhibitor herbicides

2．2 提取方法的比較

6種新型ALS抑制劑類除草劑為弱酸性農(nóng)藥，其pKa值范圍在3～5.2，酸性提取溶劑可使目標分析物保持非離子化狀態(tài)，促進在有機溶劑中的溶解，進而提高萃取回收率。本文根據(jù) Arias等［37］和Pang等［39］研究結(jié)果選擇乙腈(含1.0%甲酸溶液)作為提取溶劑。為比較超聲輔助提取與QuEChERS提取兩種方法的提取效率，本試驗通過在油菜籽、大豆、花生米和葵花籽4種油料基質(zhì)中添加10.0 μg/kg的分析物，按1.3.1和1.3.2節(jié)的提取條件考察不同方法的提取回收率。

試驗結(jié)果如圖2所示，大豆、花生米和葵花籽中的6種除草劑經(jīng)QuEChERS方法提取回收率均在80.0%以上，但對油菜籽中除草劑的提取回收率較低，其提取效率為67.0%～79.3%;當采用超聲波輔助提取后，各基質(zhì)中6種化合物的提取效率均顯著上升至83.9%～104.7%。因此本試驗最終將超聲輔助提取作為樣品前處理提取方法。

2．3 凈化方法優(yōu)化

油料作物所含的多種基質(zhì)與農(nóng)藥具有相似理化性質(zhì)，導(dǎo)致共提物抑制或增強目標化合物的離子化效率。實驗選取油菜籽為研究對象，樣品經(jīng)1.3.1節(jié)方法提取后，取上清液，分別加入含 100 mg GCB、100 mg Florisil、100 mg PSA、100 mg C18、100 mg EMR粉末(均含1.2 g無水MgSO4)的萃取管中凈化制備空白基質(zhì)溶液。分別用乙腈和凈化后的空白基質(zhì)溶液配制相同質(zhì)量濃度(10.0 μg/L)的混合標準溶液，在1.4節(jié)條件下測定。參照劉進璽等［41］的方法計算基質(zhì)效應(yīng):基質(zhì)效應(yīng)(ME)=B/A×100%，其中B為目標化合物在空白基質(zhì)溶液中的響應(yīng)值，A為目標化合物在乙腈中的響應(yīng)值。通過基質(zhì)效應(yīng)來考察各吸附劑的凈化效果，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，甲基二磺隆、嘧苯胺磺隆、乙氧嘧磺隆和雙草醚4種除草劑在凈化后的空白基質(zhì)溶液中的回收率分別為 61.3%、74.1%、74.5%和125.5%，存在不同程度的基質(zhì)抑制(回收率＜90%)或基質(zhì)增強(回收率＞110%)效應(yīng)。結(jié)果表明，GCB、Florisil和PSA對油料樣品的凈化作用較弱，甲基二磺隆、嘧苯胺磺隆和雙草醚經(jīng)凈化后仍存在較強的抑制效應(yīng)。C18和EMR對油菜籽中脂質(zhì)的吸附作用較強，可顯著減小樣品雜質(zhì)對6種除草劑的基質(zhì)干擾，基質(zhì)加標回收率分別為85.9%～104.7%和89.2%～93.2%。

圖2 兩種提取方法下各基質(zhì)中6種新型ALS抑制劑類除草劑的提取效率(n=3)Fig．2 Extraction efficiencies of the six novel ALS inhibitor herbicides in different matrices using two extraction methods(n=3)UAE:ultrasound assisted extraction．

此外，通過向空白油菜籽樣品中添加10.0 μg/kg的6種除草劑，以加標回收率進一步考察各種凈化材料對目標化合物的吸附作用。試驗結(jié)果(見圖4)表明，各吸附劑對6種除草劑的吸附作用存在差異:5種凈化材料對嘧草醚吸附作用均較小，但GCB和PSA對雙草醚、嘧苯胺磺隆、甲基二磺隆和氯吡嘧磺隆的吸附作用達9.5%～38.8%，主要原因可能是由于GCB對含平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和對稱性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有較強的保留作用［42］，而PSA含堿性基團，易吸附弱酸性農(nóng)藥［37，43］;盡管 C18 對脂質(zhì)具有較好的凈化效果，但對甲基二磺隆、乙氧嘧磺隆、雙草醚和嘧苯胺磺隆4種化合物仍具有吸附作用，可吸附10.0%～15.0%的目標分析物。為在提高凈化效率的同時避免對目標化合物的吸附損失，本試驗最終選用ERM吸附劑為分散固相萃取凈化材料。

圖3 不同吸附劑對油菜籽中6種新型ALS抑制劑類除草劑基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=3)Fig．3 Influence of matrix effects of the six novel ALS inhibitor herbicides in rapeseed by different adsorbents(n=3)GCB:graphitized carbon black;C18:ostade-cylsilane;PSA:primary-secondary amine;EMR:enhanced matrix removal．

圖4 不同吸附劑對油菜籽中6種新型ALS抑制劑類除草劑的吸附作用(n=3)Fig．4 Adsorption effects of the six novel ALS inhibitor herbicides in rapeseed by different adsorbents(n=3)

2．4 線性范圍、檢出限和定量限

將6種除草劑用油菜籽的空白基質(zhì)樣品溶液配制成系列質(zhì)量濃度混合標準溶液，利用外標法定量，分別以6種化合物峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線，以1/x為權(quán)重計算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果(見表2)表明，6種化合物在 0.05～500.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不低于0.998 4。在油菜籽、大豆、花生米和葵花籽4種空白樣品中添加6種ALS抑制類除草劑標準溶液，以S/N≥3和S/N≥10分別確定為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。6種農(nóng)藥的LOD為0.08～0.8 μg/kg，LOQ 為 0.25～2.5 μg/kg。該方法所得定量限均低于各國對6種農(nóng)藥在基質(zhì)樣品中的MRLs(maximum residue limits)值，可用于 ALS抑制類除草劑的殘留量監(jiān)測。

表2 6種新型ALS抑制類除草劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限與定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LODs)and limits of quantification(LOQs)of the six novel ALS inhibitor herbicides

2．5 方法準確度和精密度

為考察方法的準確度和精密度，分別稱取油菜籽、大豆、花生米和葵花籽4種空白樣品粉末各5.0 g，參照歐盟、日本等國家的 MRLs 值［13，14］，分別向離心管中添加3個不同水平的甲基二磺隆、乙氧嘧磺隆、氯吡嘧磺隆和嘧草醚(0.25、1.0、10.0 μg/kg)和雙草醚、嘧苯胺磺隆(2.5、10.0、100.0 μg/kg)標準溶液，按1.3節(jié)的方法重復(fù)測定6次，回收率及精密度結(jié)果見表3。

由表3可以看出，6種ALS抑制類除草劑的平均回收率為70.7%～103.8%，相對標準偏差為0.8%～9.2%。

表3 4種油料作物中6種新型ALS抑制劑類除草劑在3個添加水平下的回收率及其RSD(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the six novel ALS inhibitor herbicides at the three spiked levels in the four oil crops(n=6)

2．6 實際樣品測定

采用本方法對當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場、超市和網(wǎng)上超市隨機購買的油菜籽、大豆、花生米、芝麻和葵花籽等50份油料樣品進行測定。每個基質(zhì)選擇3個樣品，在每個樣品中加入混合標準溶進行過程控制。結(jié)果表明，不同來源的樣品中均未檢出6種新型ALS除草劑。油菜籽加標樣品中各化合物的定量離子色譜圖見圖5。

圖5 6種新型ALS抑制劑類除草劑在油菜籽樣品中的定量離子色譜圖Fig．5 Quantitative ion chromatograms of the six novel ALS inhibitor herbicides in a rapeseed sampleBispyribac-sodium and orthosulfamuron were spiked at 10 μg/kg;mesosulfuron-methyl，halosulfuron-methyl，pyriminobacmethyl and ethoxysulfuro were spiked at 1 μg/kg．

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取4種油料基質(zhì)中甲基二磺隆、氯吡嘧磺、雙草醚、嘧草醚、嘧苯胺磺隆和乙氧嘧磺隆6種新型ALS抑制劑類除草劑，以EMR為吸附劑的分散固相萃取法凈化后用LC-MS/MS外標法分析。優(yōu)化了提取方法和吸附劑種類，可減小油料作物中脂質(zhì)、色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)對目標分析物的干擾，避免儀器污染，確保分析結(jié)果的準確度和可信度。該方法準確度高，精密度好，具有較高的靈敏度和重現(xiàn)性，滿足目前國內(nèi)外機構(gòu)對作物中6種新型ALS抑制劑類除草劑的限量要求，可用于油料作物中低殘留農(nóng)藥的痕量分析。