何世偉， 趙永綱，2， 朱 巖*

(1．浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州310027;2．寧波市疾病預(yù)防控制中心，浙江寧波315010)

氯霉素是一種高效、廣譜抗生素，可有效抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，它能有效地滲入腦脊液中，對(duì)于治療多種細(xì)菌性腦膜炎有相當(dāng)療效［1］。然而，氯霉素對(duì)造血系統(tǒng)的毒性頗為嚴(yán)重，可引起人粒細(xì)胞缺乏病再生障礙性貧血和溶血性貧血［2－6］。將氯霉素分子中的對(duì)位硝基用甲磺酰基取代即為甲砜霉素，其抗菌譜和應(yīng)用范圍與氯霉素基本相同，但毒性降低。氟甲砜霉素是甲砜霉素的衍生物，也具有氯霉素的再生障礙性貧血等毒副作用。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的化學(xué)性質(zhì)都極為穩(wěn)定，在人體內(nèi)容易產(chǎn)生藥物殘留。因此，建立一種監(jiān)測(cè)血液中殘留氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)方法可以指導(dǎo)臨床用藥，增強(qiáng)療效的同時(shí)有效避免和減少毒副反應(yīng)。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［7－12］。其中，LC-MS/MS 法具有通量大、選擇性高與靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，更適于復(fù)雜基質(zhì)中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定性與定量分析。S＇niegocki等［7］采用 LC-MS/MS 方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞蛋、奶酪、牛奶、香腸等20多種動(dòng)物源性食品中殘留氯霉素的測(cè)定。然而，LC-MS/MS方法的精密度與準(zhǔn)確度容易受到基質(zhì)效應(yīng)的干擾［13，14］，對(duì)于血液樣品而言，其中的磷酯類物質(zhì)是干擾LC-MS/MS方法精密度與準(zhǔn)確度的主要來(lái)源［15－17］。目前，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的前處理方法主要包括液液萃取與固相萃取，然而，液液萃取分析時(shí)間長(zhǎng)，且溶劑消耗量大;固相萃取大多采用先吸附目標(biāo)物再洗脫的策略，需要溶劑替換，且操作步驟相對(duì)繁瑣。

2015年，美國(guó)沃特世公司開發(fā)了一種用于去除樣品中磷脂與蛋白質(zhì)等基質(zhì)的Oasis PRiME HLB通過(guò)型固相萃取柱，該前處理方法快速、高效，可有效降低磷酯類物質(zhì)對(duì)LC-MS/MS方法造成的基質(zhì)效應(yīng)。近年來(lái)，在Oasis PRiME HLB通過(guò)型固相萃取柱的基礎(chǔ)上，諸多新型的吸附填料，如磁性羧基化石墨烯(Mag-CG)［16］、磁性羧基化碳納米管(Mag-CCNTs)［16］以及 TiO2修飾石墨烯［18］等被開發(fā)出來(lái)，并作為PRiME通過(guò)型固相萃取柱填料用于去除血液樣品中磷脂類物質(zhì)的干擾。

本文在對(duì)多種固相萃取方法系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，采用PRiME通過(guò)型固相萃取方法凈化血液樣品中殘留的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，并采用自制的TiO2修飾磁性石墨烯作為PRiME通過(guò)型固相萃取柱填料用于去除血液樣品中磷脂類物質(zhì)的干擾，有效克服了LC-MS/MS分析過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物定量影響。采用TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液中殘留氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的方法尚未見報(bào)道。本文將快速、高通量的PRiME通過(guò)型固相萃取凈化、超快速的液相色譜分離和高靈敏、高選擇性的電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液中殘留痕量氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

Prominence UFLC XR型超快速高分離液相色譜儀配有LC-20AD輸液泵、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱和DGU-20A3脫氣機(jī)(日本島津株式會(huì)社);API 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)和Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Legend RT型離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司);全玻璃溶劑過(guò)濾器(美國(guó)Waters公司)。

乙腈為HPLC級(jí)(德國(guó)Merck公司)，所有的溶劑使用前均使用0.22 μm濾膜過(guò)濾。超純水(18.2 MΩ·cm)，氯霉素(純度大于98.0%)、甲砜霉素(純度大于 98.0%)、氟甲砜霉素(純度大于98.0%)、氯霉素-D5(純度大于98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司，血液樣品采集于寧波市第二醫(yī)院。Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)與Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)購(gòu)自美國(guó)Waters公司。TiO2修飾磁性石墨烯材料與TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱為實(shí)驗(yàn)室自制，其制備方法見文獻(xiàn)［18］。本文所制備的TiO2修飾磁性石墨烯材料由厚度為30 nm的花瓣形納米薄片有序堆疊而成，其透射電子顯微鏡圖譜如圖1所示。

圖1 TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱凈化血液樣品Fig．1 Nano-titania-coated modified magnetic graphene oxide(TiO2-Mag-GO)PRiME pass-through cleanup for the human blood sample

1．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素-D5各10.0 mg于4個(gè)10.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取濃度為1.0 g/L的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各10 μL于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法制得1.0 mg/L的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1．3 樣品前處理方法

1．3．1 樣品提取

準(zhǔn)確移取100 μL全血樣品于5.0 mL刻度離心管中，加入100.0 μg/L氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液4.0 μL，以乙腈定容至2.0 mL，渦旋5.0 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一支5.0 mL刻度離心管中。

1．3．2 樣品凈化

上清液全量轉(zhuǎn)移至TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱，流速0.5 mL/min，收集1.0 mL流出液，N2吹至近干，以初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?100 μL，過(guò) 0.2 μm 微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定。樣品凈化示意圖如圖1所示。

1．4 色譜質(zhì)譜條件

1．4．1 色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);進(jìn)樣量:10.0 μL;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:含0.08%(v/v)氨水水溶液(A)和含0.08%(v/v)氨水的乙腈溶液(B)。梯度洗脫程序:0～1.00 min，30.0%B～90%B;1.00～3.00 min，90.0%B;3.01～5.00 min，30.0%B。

1．4．2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負(fù)離子掃描;定量檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;電噴霧電壓(IS):－4 500 V;霧化氣壓力(GS1):340 kPa;輔助氣壓力(GS2):340 kPa;氣簾氣壓力(CUR):276 kPa;碰撞氣壓力(CAD):41 kPa;離子源溫度(TEM):500℃;掃描時(shí)間:50 ms;碰撞室出口電壓(CXP):－10.0 V;碰撞室入口電壓(EP):－10.0 V;定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量(CE)及去簇電壓(DP)見表1。

1．4．3 定性及定量

3種目標(biāo)化合物采用保留時(shí)間結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜三離子定性原則進(jìn)行定性，以靈敏、穩(wěn)定且無(wú)干擾的Q1/Q3離子對(duì)為定量離子對(duì)(見表1)，內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2．1 質(zhì)譜條件的選擇

在利用超快速液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)的過(guò)程中，為了獲得最佳的質(zhì)譜條件以保證對(duì)分析物定量和定性的準(zhǔn)確性，必須對(duì)待測(cè)物的母離子、子離子、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

表1 目標(biāo)物的定性定量離子對(duì)及去簇電壓、碰撞能量與保留時(shí)間Table 1 Q1/Q3 ion pairs，declustering potential(DP)，collision energy(CE)and retention time of the analytes

本研究采用針泵進(jìn)樣的方式，首先采用前級(jí)離子掃描(Q1 Scan)方式獲取待測(cè)物的母離子，之后采用子離子掃描方式(Q3 Scan)通過(guò)優(yōu)化碰撞能量獲得產(chǎn)物離子，最后采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。在上述優(yōu)化的LC-MS/MS條件下，空白樣品加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.5 μg/L的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素MRM圖譜如圖2所示。

圖2 空白加標(biāo)樣品(0.5 μg/L)的MRM色譜圖Fig．2 MRM chromatograms of blank sample spiked at 0.5 μg/La．thiamphenicol;b．florfenicol;c．chloramphenicol．

2．2 提取溶劑對(duì)3種目標(biāo)化合物回收率的影響

為了實(shí)現(xiàn)樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的快速篩查和確證，本研究考察了提取溶劑對(duì)3種目標(biāo)化合物回收率的影響。在固定其他實(shí)驗(yàn)條件的前提下，本文選取乙腈與乙酸乙酯作為提取溶劑，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)采用乙腈作為提取溶劑時(shí)，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率分別為92.2%、98.5%、99.2%;當(dāng)采用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，3種目標(biāo)化合物的回收率在122%～136%。這種現(xiàn)象可以解釋為:乙酸乙酯在提取3種目標(biāo)化合物的同時(shí)溶解了更多的脂溶性雜質(zhì)，致使TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱達(dá)到飽和，進(jìn)而無(wú)法有效消除樣品提取液中的雜質(zhì)，造成基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。鑒于此，本文采用乙腈作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影響(n=3)Fig．3 Effect of extraction solvents on the recoveries of thiamphenicol，florfenicol and chloramphenicol(n=3)

2．3 固相萃取柱流速的優(yōu)化

本文選擇TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱作為樣品凈化方法，避免了傳統(tǒng)SPE方法中對(duì)SPE小柱活化、淋洗與洗脫等步驟，進(jìn)而縮短樣品前處理時(shí)間。在保證目標(biāo)物回收率的前提下，應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成血液樣品中甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的提取與凈化。因此，本文考察了TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱流速對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明:固相萃取柱流速對(duì)于甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率有顯著影響。當(dāng)其流速在0.1～0.6 mL/min之間時(shí)，回收率為89.2%～107%;然而，隨著流速的增加，其回收率顯著升高，當(dāng)其流速在0.7～1.0 mL/min之間時(shí)，其回收率為129%～142%。這種現(xiàn)象可以解釋為:隨著流速的增加，樣品提取液中的雜質(zhì)無(wú)法保留在TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱中，進(jìn)而無(wú)法有效消除樣品提取液中的雜質(zhì)所造成的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。鑒于此，本文采用的固相萃取柱流速為0.5 mL/min。

2．4 TiO2修飾磁性石墨烯復(fù)合材料用量的優(yōu)化

圖4 TiO2修飾磁性石墨烯的用量對(duì)甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影響(n=3)Fig．4 Effect of the usage amount of TiO2-Mag-GO composites on recoveries of thiamphenicol，florfenicol，and chloramphenicol(n=3)

本文采用自制的TiO2修飾磁性石墨烯作為PRiME通過(guò)型固相萃取柱的填料，以期在保證目標(biāo)物回收率的同時(shí)，利用盡可能少的TiO2修飾磁性石墨烯有效地去除血液樣品中磷脂等雜質(zhì)。為了獲得TiO2修飾磁性石墨烯的最佳用量，本文考察了TiO2修飾磁性石墨烯用量在40～200 mg范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)TiO2修飾磁性石墨烯用量為40 mg時(shí)，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率在126%～132%范圍內(nèi)。這一現(xiàn)象可以解釋為:樣品提取液中的雜質(zhì)無(wú)法全部保留在TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱中，進(jìn)而無(wú)法有效消除樣品提取液中的雜質(zhì)所造成的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。隨著TiO2修飾磁性石墨烯石墨烯用量的增加，樣品提取液中的雜質(zhì)所引起的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)逐漸減弱。當(dāng)材料用量為100～200 mg時(shí)，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率穩(wěn)定在91.0%～109%。綜上所述，本文選取100 mg TiO2修飾磁性石墨烯為PRiME通過(guò)型固相萃取柱填料的最佳用量。此外，本文考察了市售Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)與TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱對(duì)3種目標(biāo)分析物凈化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)處理血液加標(biāo)樣品，甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的回收率為129%～142%;采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)與TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱處理血液加標(biāo)樣品，目標(biāo)分析物的回收率分別為89.2%～116%和91.0%～109%。由此可知，本文所制備的TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱與Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)對(duì)血液樣品中甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的凈化能力相當(dāng)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2．5 基質(zhì)效應(yīng)

本文采用空白基質(zhì)加標(biāo)樣品中目標(biāo)物的峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積之比［16］對(duì)血液中甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素在使用PRiME通過(guò)型固相萃取柱凈化前后的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表2所示。未經(jīng)PRiME通過(guò)型固相萃取柱凈化的血液加標(biāo)樣品，其基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較為顯著(138%～195%);采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)處理血液加標(biāo)樣品，甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的基質(zhì)效應(yīng)為120%～140%;采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)與TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱處理血液加標(biāo)樣品，目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)分別為92.2%～117%與89.6%～112%。本文所制備的TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱與Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)可有效降低血液樣品中基質(zhì)對(duì)甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

表2 血液中甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素在使用PRiME通過(guò)型固相萃取柱凈化前后的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)(n=6)Table 2 Absolute matrix effects of thiamphenicol，florfenicol，and chloramphenicol in human blood before and after PRiME pass-through cleanup procedure(n=6)

2．6 校正曲線、檢出限、定量限、精密度與回收率

為了驗(yàn)證3種目標(biāo)化合物的線性，配制了一系列甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法定量。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定10次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素在0.1～10.0 μg/L的范圍具有良好的線性關(guān)系(決定系數(shù) r2＞0.999)。

采用在空白血樣中添加目標(biāo)組分的方法，根據(jù)MRM色譜峰的3倍信噪比和10倍信噪比確定3種目標(biāo)組分的最低檢出限和定量限，甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的LOD與LOQ分別為0.017～0.025 μg/L與0.056～0.082 μg/L。以不含待測(cè)物的血液樣品為空白，以甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的加標(biāo)水平分別為0.16、1.6和8.0 μg/L的各10個(gè)平行樣進(jìn)行回收率和精密度考察，目標(biāo)組分在3個(gè)不同水平的全血加標(biāo)回收率分別為91.6%～102%、90.0%～105%和 91.2%～99.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.7%～5.0%、3.8%～6.6%和 1.2%～5.4%(見表3)。

表3 空白人血樣品中3個(gè)加標(biāo)水平下的線性方程、回收率、精密度、檢出限、定量限以及決定系數(shù)(n=10)Table 3 Linear equations，recoveries，precisions，LODs，LOQs and determination coefficients obtained for analytes at three spiked levels in blank human blood samples(n=10)

2．7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)全血中甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的方法，對(duì)采集的20份全血樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:所采集的20份樣品中，有1份檢測(cè)出氟甲砜霉素，其含量為3.10 μg/L，陽(yáng)性樣品的MRM色譜圖如圖5所示。

圖5 陽(yáng)性血液樣品的MRM色譜圖Fig．5 MRM chromatogram of a positive blood sample

3 結(jié)論

本文利用自制的TiO2修飾磁性石墨烯復(fù)合材料作為PRiME通過(guò)型固相萃取柱的填料，有效去除了全血樣品中的脂肪酸、酸性磷脂等基體干擾物對(duì)甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的基體增強(qiáng)效應(yīng)。建立的采用TiO2修飾磁性石墨烯-PRiME通過(guò)型固相萃取柱-LC-MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下測(cè)定全血中甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，其定量限在0.056～0.082 μg/L范圍內(nèi)，能較好地用于臨床全血樣品中痕量甲砜霉素、氟甲砜霉素與氯霉素的測(cè)定，可以有效指導(dǎo)臨床用藥，增強(qiáng)療效的同時(shí)有效避免和減少毒副反應(yīng)。