萬永青，張 杰，侯向陽，王照蘭，馬玉寶，萬其號(hào)，萬東莉*

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草原研究所，農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復(fù)治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010010；2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010011)

植物在其生長(zhǎng)的自然環(huán)境中不斷地遭受各種生物和非生物逆境脅迫，為了在這樣的條件下生存，植物進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來感知外部信號(hào)，從而對(duì)環(huán)境刺激做出最佳的響應(yīng)[1]。脫水素(dehydrins, DHNs)是2組LEA亞家族蛋白，其表達(dá)在種子發(fā)育后期大量積累，并且受缺水、鹽、低溫和ABA等不同逆境脅迫處理的誘導(dǎo)[2]。脫水素的表達(dá)能增加植物對(duì)低溫、脫水、干旱、鹽和滲透等脅迫的忍耐性[3-8]。脫水素最初在棉花發(fā)育的胚胎中被鑒定為“D-11”家族蛋白[9]。脫水素蛋白高度親水，含有高比例的帶電極性氨基酸和低比例的疏水性、非極性殘基，且缺乏色氨酸和半胱氨酸殘基[9]。根據(jù)保守序列Y-、S-和K-片段的包含方式，脫水素被分為五種類型：Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn[4, 10]。其中K-片段(EKKGIMDKIKEKLPG或類似的序列)存在于所有的脫水素中，是一段高度保守的、賴氨酸富集的序列，與A2親水性α-螺旋形成以及與一些大分子結(jié)合有關(guān)，位于接近于脫水素蛋白C末端的位置，每個(gè)脫水素含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的K-片段[10-13]。Y-片段(V/TDEYGNP或類似的序列)與分子伴侶的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)有部分相似性，位于接近于脫水素蛋白N末端的位置，一般有1～3個(gè)拷貝[8, 10]。S-片段(LHRSGSSSSSSSEDD 或相關(guān)的序列)是磷酸化位點(diǎn)，主要由5～7個(gè)連續(xù)的色氨酸殘基和緊隨其后的3個(gè)氨基酸組成[8, 11]。

羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel)隸屬禾本科小麥族(TriticeaeDumort.)賴草屬(LeymusHochst.)，是歐亞大陸草原區(qū)東部草甸草原及典型草原上的重要建群種之一，在蒙古、俄羅斯和哈薩克斯坦以及中國(guó)的東北三省、內(nèi)蒙古和新疆等省區(qū)廣泛分布[14]。羊草具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，如極端溫度、干旱和高鹽堿[15]。近幾年關(guān)于羊草抗逆基因的研究逐漸增多，如LcMYB1[16]、LcSAIN1[17]和LcSAIN2[18]提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，LcFIN1[19]和LcWRKY5[20]分別提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)冷和干旱的耐受能力，LcSAMDC1能同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)冷和鹽的耐受性[21]。此外，MADS-box家族基因參與了羊草對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)[22]。

本研究通過對(duì)羊草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得的1個(gè)LcDHN3基因進(jìn)行了克隆，對(duì)該基因及其蛋白編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)不同逆境脅迫下LcDHN3基因的表達(dá)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開展LcDHN3參與逆境脅迫響應(yīng)的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與脅迫處理

將羊草“吉生4號(hào)”種子播種于裝有蛭石和營(yíng)養(yǎng)土(2∶1)的培養(yǎng)缽中，置于16 h光照/8 h黑暗、溫度為23～25 ℃的溫室培養(yǎng)。生長(zhǎng)30 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的羊草用于不同的脅迫處理。

干旱、鹽、高pH、ABA和JA處理：將羊草植株從培養(yǎng)缽中取出并用清水清洗干凈，將小苗置于濾紙進(jìn)行干旱處理，將小苗根部分別浸泡在300 mmol/L NaCl溶液、200 mmol/L碳酸氫鈉溶液(pH 10)、100 μmol/L ABA水溶液和100 μmol/L JA水溶液中進(jìn)行鹽、高pH、ABA和JA處理[23-25]。

冷、熱和機(jī)械損傷處理：將羊草植株連同培養(yǎng)缽分別置于4 ℃和42 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷和熱處理；將培養(yǎng)缽中羊草植株的每個(gè)葉片采用0.45 mm×15.5 mm的無菌針頭穿刺3孔進(jìn)行機(jī)械損傷處理。

在處理的不同時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、3、6、12、24和48 h)取樣，以0 h未處理樣品作為對(duì)照。每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)取3株植物地上組織混合并迅速放入液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存作為后續(xù)檢測(cè)的樣品。共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成按照植物RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)的說明提取羊草地上組織總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的步驟進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2LcDHN3基因克隆將羊草轉(zhuǎn)錄組中篩選到的LcDHN3序列，通過NCBI的Blastx進(jìn)行比對(duì)，采用DNAMAN7軟件分析獲得LcDHN3的ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。

采用軟件Primer Premier 5.0，設(shè)計(jì)LcDHN3基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增引物L(fēng)cDHN3-F/LcDHN3-R(表1)。以羊草cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：5×PrimeSTAR?緩沖液 10 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 32.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸5 min，16 ℃保存。目的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒(天根)回收后，與pEASY-BluntSimple載體(全式金)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選后利用M13引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

表1 引物序列

1.2.3序列生物信息學(xué)分析利用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線預(yù)測(cè)LcDHN3的保守結(jié)構(gòu)域。

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)分析LcDHN3蛋白的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)、脂肪系數(shù)(aliphatic index)、平均親水系數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)和各氨基酸的組成等。利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_ automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)分析LcDHN3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)，采用k-NN(k-nearest neighbor)算法，預(yù)測(cè)LcDHN3蛋白的亞細(xì)胞定位。

利用NCBI blastp進(jìn)行在線比對(duì)分析，挑選出相似性較高的同源蛋白序列，利用DNAMAN7進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)合PROSITE(https://prosite.expasy.org/)分析保守區(qū)域序列和基序。同時(shí)，從Blastp比對(duì)結(jié)果中挑取不同物種的同源序列。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源序列分別從基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.medicagogenome.org/)和TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中獲得。運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4LcDHN3基因表達(dá)分析通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同逆境脅迫處理下目的基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。利用羅氏 LightCycler 480 Real-Time PCR System，TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，具體參考方法[26]。以羊草LcActin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法對(duì)LcDHN3基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。引物序列詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcDHN3基因克隆與保守結(jié)構(gòu)域分析

以羊草的cDNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組獲得的羊草DHN3序列設(shè)計(jì)基因特異引物，PCR擴(kuò)增獲得的LcDHN3基因片段，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證，利用NCBI blastx進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示該基因具有完整的ORF，全長(zhǎng)為501 bp(圖1)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，編碼167 aa，在GenBank的登錄號(hào)為MH551243。

利用NCBI CDD分析顯示，LcDHN3具有Dehydrin superfamily保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。通過NCBI blastp比對(duì)結(jié)果顯示LcDHN3與其他植物的DHNs具有較高相似性，其中與大麥(Hordeumvulgare)的DHN3相似性最高，為92%。與同屬于禾本科植物小麥(Triticumaestivum)的salt-induced YSK2 dehydrin 2、長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumelongatum)的dehydrin-/LEA group 2-like protein、粗山羊草(Aegilopstauschii)的dehydrin DHN3-like、 冰草(Agropyroncristatum)的drought acclimation dehydrin WZY2和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的dehydrin DHN3比對(duì)的相似性分別為88%、84%、83%、91%和73%。

M.DL2000；1～4.LcDHN3 ORF圖1 PCR克隆LcDHN3基因Fig.1 PCR cloning of LcDHN3 gene

圖2 LcDHN3蛋白功能位點(diǎn)分析Fig.2 Conserved domain analysis of LcDHN3 protein

A. LcDHN3;B.長(zhǎng)穗偃麥草(AAC05922.1);C. 大麥(ALL25871.1);D. 粗山羊草(XP_020188299.1);E. 冰草(AEJ88293.1);F. 普通小麥(AOM63238.1);G. 二穗短柄草(XP_010227582.1); 粉色箭頭代表Y-片段，紅色箭頭代表S-片段，紅色線段代表K-片段圖3 LcDHN3與其他物種DHNs同源比對(duì)A. LcDHN3; B.Thinopyrum elongatum (AAC05922.1); C. Hordeum vulgare (ALL25871.1); D. Aegilops tauschii (XP_020188299.1); E. Agropyron cristatum (AEJ88293.1); F. Triticum aestivum (AOM63238.1); G. Brachypodium distachyon (XP_010227582.1); Pink arrow represents Y-segment, red arrow represents S-segment, red lines represent K-segmentsFig.3 Multiple alignment of LcDHN3 and homology sequences from other plants

2.2 LcDHN3蛋白理化特性分析

用在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，LcDHN3分子量17.01 kD，理論等電點(diǎn)為8.05，氨基酸序列的分子式為C703H1120N234O248S6；LcDHN3蛋白的氨基酸組成中，不包含色氨酸和半胱氨酸，其中甘氨酸所占的比例最高為25.1%，苯丙氨酸所占的比例最低為0.6%。親疏水性分析顯示LcDHN3蛋白的總平均疏水指數(shù)小于0，為-1.085，表明屬于親水性蛋白。脂肪系數(shù)為33.35，不穩(wěn)定指數(shù)為21.45，低于40，因此認(rèn)為L(zhǎng)cDHN3是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)[27]。

GOR4在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LcDHN3蛋白含有3種結(jié)構(gòu)：其中無規(guī)則卷曲比例最多為59.28%，其次為延伸鏈比例為24.55%，α螺旋的比例最少為16.17%。通過PSORT對(duì)LcDHN3蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示LcDHN3在不同亞細(xì)胞定位的k-NN指數(shù)分別為：細(xì)胞質(zhì)39.1%，細(xì)胞核34.8%，線粒體21.7%，高爾基體4.3%；NNCN(Reinhardt’s method)[28]預(yù)測(cè)結(jié)果為L(zhǎng)cDHN3定位于細(xì)胞質(zhì)，因此推測(cè)LcDHN3優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

2.3 LcDHN3同源比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3顯示，LcDHN3與其他植物的DHNs氨基酸序列的整體相似性為84.27%。進(jìn)一步結(jié)合PROSITE對(duì)LcDHN3的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LcDHN3含有1個(gè)Y-片段(位于N 端)、1個(gè)S-片段和2個(gè)K-片段(位于C端)(圖3)。

聚類分析結(jié)果(圖4)顯示，LcDHN3蛋白與大麥的DHN蛋白聚為一個(gè)小的分支，然后與長(zhǎng)穗偃麥草和粗山羊草的DHNs共同聚在一個(gè)較大的分支，表明LcDHN3蛋白與大麥的DHN親緣關(guān)系最近，其次為長(zhǎng)穗偃麥草和粗山羊草的DHNs，而與蒺藜苜蓿和擬南芥的DHNs關(guān)系較遠(yuǎn)。

進(jìn)化樹采用鄰近法構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)為1 000次圖4 LcDHN3的系統(tǒng)進(jìn)化樹The phylogenetic tree is constructed using the neighbor joining method, Bootstrap values based on 1 000 replications.Fig.4 The phylogenetic tree of LcDHN3

圖5 不同逆境脅迫下LcDHN3的表達(dá)Fig.5 The expression patterns of LcDHN3 under different stress treatments

2.4 逆境脅迫下LcDHN3的表達(dá)分析

2.4.1非生物逆境脅迫下LcDHN3的表達(dá)圖5表明，不同逆境脅迫處理均能強(qiáng)烈誘導(dǎo)LcDHN3基因表達(dá)。干旱和冷脅迫下，LcDHN3基因在處理3 h開始被誘導(dǎo)表達(dá)，12 h達(dá)到峰值，分別是對(duì)照的152和7倍。在NaCl脅迫下，LcDHN3基因在處理0.5 h被誘導(dǎo)表達(dá)，在24 h表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照的34倍。在熱脅迫下，LcDHN3基因表達(dá)在處理1 h被誘導(dǎo)表達(dá)，隨著處理時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，在48 h時(shí)表達(dá)量最高為對(duì)照的121倍。高pH(10)處理下，LcDHN3基因表達(dá)在0.5 h開始被誘導(dǎo)表達(dá)，在3 h表達(dá)量達(dá)到峰值并持續(xù)到6 h，是對(duì)照的18倍，之后表達(dá)量開始下降，但是在處理48 h時(shí)，表達(dá)量又開始增加，達(dá)到對(duì)照的15倍。機(jī)械損傷脅迫0.5 h后，LcDHN3基因表達(dá)被迅速誘導(dǎo)，并在1 h時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照的56倍。

圖6 ABA和JA處理下LcDHN3的表達(dá)Fig.6 The expression patterns of LcDHN3 under ABA and JA treatments

2.4.2相關(guān)激素脅迫下LcDHN3的表達(dá)圖6顯示，LcDHN3基因表達(dá)被ABA處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在處理0.5 h時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，是對(duì)照的2倍，在48 h達(dá)到峰值，是對(duì)照的54倍。同時(shí)，LcDHN3基因表達(dá)也受JA誘導(dǎo)，在處理1 h時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，6 h時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照的16倍。

3 討 論

脫水素是研究最廣、最具有特征的一類LEA蛋白[2]，存在于已經(jīng)研究的所有高等植物中[13]，在大麥[29]、擬南芥[30]和水稻[31]中分別鑒定了13、10和8個(gè)DHNs。此外，DHNs也存在于藻類植物、苔蘚類植物、酵母和藍(lán)細(xì)菌等生物中[13, 32-33]。

本研究從羊草中克隆得到一個(gè)LcDHN3基因。通過同源蛋白序列比對(duì)顯示其與大麥等6種植物同源序列的整體相似性為84.27%，表明具有較高的保守性。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示LcDHN3與大麥的DHN親緣關(guān)系最近，同時(shí)和長(zhǎng)穗偃麥草和粗山羊草的DHN親緣關(guān)系也較近。脫水素最顯著的特征就是所有的DHN都含有至少一個(gè)拷貝的、保守的K-片段[33]，保守基序分析顯示LcDHN3含有2個(gè)K-片段(RKKGIKEKIKEKLPG和EKKGIMDRIKEKLPG)，1個(gè)Y-片段(VDEYGNP)和1個(gè)S-片段(LQRSGSSSSSSSEDD)，因此為YSK2型脫水素。理化特性分析顯示LcDHN3是親水蛋白，不含有色氨酸和半胱氨酸，這與脫水素所具有的特性一致[9]。

研究表明，DHN蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中分布于不同的組織，亞細(xì)胞定位于不同的細(xì)胞器，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、質(zhì)膜、線粒體和液泡，但是主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[33]。例如，玉米ABA響應(yīng)蛋白rab17是一個(gè)YSK2型脫水素，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)[34]。本研究通過NNCN(Reinhardt's方法根據(jù)氨基酸組成來判斷細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的傾向)分析LcDHN3優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)在LcDHN3蛋白序列中預(yù)測(cè)到了一個(gè)YnSKn型脫水素特有的核定位信號(hào)“RRKK”，且擁有與核定位有關(guān)的S-片段[33]，結(jié)合K-NN指數(shù)(細(xì)胞質(zhì)39.1%，細(xì)胞核34.8%)，推測(cè)LcDHN3可能同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

脫水素在參與植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的信號(hào)途徑中具有重要作用。例如，番茄(Solanumhabrochaites)的1個(gè)SK3型脫水素基因ShDHN在根、莖、葉、花和果實(shí)中具有組成型表達(dá)，同時(shí)在番茄耐冷品種(S.habrochaites)中的表達(dá)高于易感品種(S.lycopersicum)[3]。此外，ShDHN的表達(dá)受干旱、鹽和滲透脅迫調(diào)節(jié)，過量表達(dá)ShDHN后增加了番茄耐受冷和干旱脅迫的能力，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植物積累了脯氨酸，維持了超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的較高酶活性，減少了膜的損傷[3]。在大麥和普通小麥中大多數(shù)的脫水素都屬于YnSKn型，并且基因的表達(dá)受脫水脅迫(干旱、鹽和霜)和ABA處理等的誘導(dǎo)[35]。黃瓜(Cucumissativus)CsLEA11蛋白是一個(gè)Y3SK2型脫水素，CsLEA11基因的轉(zhuǎn)錄受熱和冷脅迫的顯著誘導(dǎo)，在大腸桿菌中過量表達(dá)CsLEA11后能增強(qiáng)細(xì)胞的活力和對(duì)冷和熱的耐受能力[36]。此外，CsLEA11蛋白可在高溫脅迫下保護(hù)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)的活性[36]。高粱YSK2型脫水素基因SbDhn1的表達(dá)受高溫和滲透脅迫的誘導(dǎo)，在煙草中過量表達(dá)SbDhn1后，轉(zhuǎn)基因株系通過減少膜損傷和降低MDA含量，提高對(duì)逆境脅迫的耐受能力[37]。本研究中，YSK2型脫水素LcDHN3的表達(dá)受不同非生物逆境脅迫(干旱、鹽、冷、熱、高pH和機(jī)械損傷)以及植物激素ABA和MeJA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表明LcDHN3參與了羊草對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)，預(yù)示其在羊草響應(yīng)非生物逆境脅迫中具有重要作用。但是LcDHN3在非生物逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑中如何作用以及處于什么位置還不清楚，亟待展開進(jìn)一步的研究對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。