王培育，王叢巧，張舒婷，王雪晶，葉 煒，賴鐘雄，林玉玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

microRNA(miRNA)是一種長度約為21～24 nt大小的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其產(chǎn)生依賴于miRNA初級體primary miRNA(pri-miRNA)的存在[1-2]。miRNA主要通過與靶mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)靶mRNA降解或翻譯進行調(diào)控，對植物基因表達、生長發(fā)育和抵抗脅迫及病害有著十分重要的影響。在已報道的一系列受病原菌侵染負調(diào)控的miRNA中，miR393是第一個被發(fā)現(xiàn)的，它主要通過負調(diào)控TIR1/AFBs的表達，從而響應(yīng)病原菌脅迫[3]。此外，miR393和miR167能夠響應(yīng)根癌農(nóng)桿菌的脅迫[4-5]；miR159前體獲得能夠增強抗病性[6]；miR398能受病原菌脅迫誘導(dǎo)最終能抵抗病原菌入侵[7]。

文心蘭(Oncidiumhybridum)為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬植物，被插花界譽為切花“五美人”之一，具有較高的經(jīng)濟價值。雖然文心蘭與其他熱帶蘭花相比，更具有廣范的適應(yīng)性，但在高溫高濕季節(jié)恰好是文心蘭的切花高峰期，此時非常容易受各種病原菌侵染，從而阻礙了文心蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。而由歐文氏菌(Erwiniaspp)侵染而引起的軟腐病(Soft rot)給文心蘭栽培產(chǎn)業(yè)帶來了毀滅性破壞，因此文心蘭的抗病研究是文心蘭栽培過程中的重要方向[9-13]。目前實驗室已做了關(guān)于OnFd基因在文心蘭響應(yīng)抗軟腐病過程中所產(chǎn)生作用的相關(guān)研究[14]。然而，有關(guān)抗文心蘭軟腐病miRNA的研究鮮有報道。在本研究中，擬利用實驗室前期已建立的文心蘭miRNA數(shù)據(jù)庫，以文心蘭‘南茜’為對象，對文心蘭miRNA的25條前體(pre-miRNAs)序列和15條成熟體序列、前體二級結(jié)構(gòu)及其在不同組織部位和軟腐病侵染下的表達譜進行系統(tǒng)分析，以期為文心蘭抗病的調(diào)控提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗所用文心蘭植株以及文心蘭轉(zhuǎn)錄組和miRNA數(shù)據(jù)庫由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。以‘南茜’文心蘭植株為材料，選取長勢相近的健康文心蘭植株10株，取其根、莖、葉組織材料，用于實時熒光定量PCR分析；同時，選取長勢相近的健康文心蘭植株10株，以制備好的軟腐病菌液注射侵染假鱗莖，放置于設(shè)定好的人工氣候箱培養(yǎng)，處理0、4、8和12 h 后取假鱗莖部位。病原菌為歐文式桿菌，其獲得是從實驗室已分離出來保存于-80 ℃冰箱的軟腐病菌菌液進行純化，病原菌的分離參考吳曉佩[13]方法。試驗均3次生物學(xué)重復(fù)。樣品經(jīng)液氮處理后保存于-80 ℃冰箱，用于總RNA的提取及后續(xù)試驗。

1.2 方 法

1.2.1文心蘭pre-miRNAs序列的獲取從本實驗室的文心蘭轉(zhuǎn)錄組和miRNA數(shù)據(jù)庫篩選pre-miRNAs和成熟體序列。從文心蘭miRNA前體中，扣除重復(fù)序列；同時獲取成熟體序列。

1.2.2文心蘭pre-miRNAs及成熟體序列分析利用DNAMAN ver.6.0軟件對上述獲得的文心蘭前體序列進行多重比對分析，并對文心蘭前體及成熟體序列進行比對分析；利用3.5版在線軟件Mfold (http://unafold.rna.albany. edu/?q=mfold)對其進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3文心蘭不同組織部位和軟腐病菌侵染過程中pre-miRNAs表達的實時熒光定量分析為了進一步了解文心蘭pre-miRNAs在植株中的潛在功能，首先采用Trizol UP RNA 提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)，提取樣品不同組織部位和軟腐病侵染下假鱗莖的總RNA。用超微量分光光度計(Thermo Electron Corp.,USA)檢測RNA 樣品濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。用Prime ScriptTMRT Reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，將已經(jīng)提取的各個組織部位總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。其次，利用DNAMAN ver.6.0對25條文心蘭前體序列進行引物設(shè)計(表1)。引物均由尚亞生物公司合成。參考TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書的方法，使用羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR儀，檢測25條pre-miRNAs在文心蘭不同組織部位及軟腐病侵染下假鱗莖中的表達情況。選用miR168-unigene0047942為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt公式計算25條pre-miRNAs在文心蘭不同組織部位和軟腐病侵染下假鱗莖中的相對表達量，3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 文心蘭25條pre-miRNAs qPCR引物

1.2.4統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖表制作用Excel軟件。用在線網(wǎng)站Omicshare(http:// www.omicshare.com)作文心蘭pre-miRNAs的表達量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭25條pre-miRNAs的篩選及序列分析

為了解文心蘭pre-miRNAs及成熟體序列特性，本研究從文心蘭轉(zhuǎn)錄組和miRNA數(shù)據(jù)庫中篩選文心蘭miRNA 31條前體，扣除重復(fù)序列，共獲得分布于13個家族的25條pre-miRNAs序列，并根據(jù)其在unigene中的位置命名(表1)。在這13個pre-miRNAs家族中，miR398、miR535和miR2950家族各含2個基因座，而miR162、miR167和miR396家族均含有3個基因座，miR168家族含4個基因座。這25條pre-miRNAs序列長度在259 (miR2950-unigene0006151)～ 883 nt(miR169-unigene0022341)間，其GC含量在29.0%～ 40.0%之間。另外，從文心蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和miRNA文庫中篩選獲取分布于13個家族的15條成熟體序列(表2)。

利用DNAMAN ver.6.0軟件對上述25條文心蘭miRNA前體及15條成熟體進行多序列比對，結(jié)果如圖1所示。除miR162家族和miR167家族有2～3個堿基差異，miR396家族中的miR396-u0019032只有8個堿基發(fā)生重疊，其余各家族序列存在一個明顯的完全重疊區(qū)，推測文心蘭miRNA成熟體可能來源于此區(qū)域。可見文心蘭miRNA家族成員進化過程可能存在高度保守區(qū)，且不同家族在由前體形成成熟體的過程中可能存在特異性。

表2 文心蘭25條pre-miRNAs 及15條成熟體

A. miR159-unigene0037857與miR159a；B. miR162家族與miR162a、162b；C. miR166-unigene0011870與miR166a；D. miR167家族與miR167a、167b；E. miR168家族與miR168a；F. miR169-unigene0022341與miR169a；G. miR171-unigene0045985與miR171a；H. miR172-unigene0006514與miR172a；I. miR396家族與miR396a；J. miR398家族與miR398a；K. miR535家族與miR535a；L. miR845-unigene0012489與miR845a；M. miR2950家族與miR2950-5p圖1 文心蘭pre-miRNAs家族序列比對分析A. miR159-unigene0037857 and miR159a; B. miR162 family and miR162a, 162b; C. miR166-unigene0011870 and miR166a; D. miR167 family and miR167a, 167b; E.miR168 family and miR168a; F. miR169-unigene0022341 and miR169a; G. miR171-unigene0045985 and miR171a; H. miR172-unigene0006514 and miR172a; I. miR396 family and miR396a; J. miR398 family and miR398a; K. miR535 family and miR535a; L. miR845-unigene0012489 and miR845a; M. miR2950 family and miR2950-5pFig.1 Analysis of pre-miRNAs sequences in O. hybridum

2.2 文心蘭25條pre-miRNAs 包含的miRNA成熟體序列分析

此外，本研究對文心蘭25條pre-miRNAs中提取出的15條miRNA成熟體，通過與已經(jīng)登錄到miRBase的植物miRNA成熟體進行比對分析。結(jié)果(圖2)顯示，不同物種miRNA成熟體序列長度絕大多數(shù)為21 nt，也有部分為22 nt，說明不同物種的各個家族miRNA成熟體主要是以21 nt的長度存在并發(fā)揮作用。15條文心蘭miRNA成熟體與擬南芥、小麥、大豆、玉米等植物的miRNA成熟體出現(xiàn)多條成熟體序列完全一致的現(xiàn)象；但也有部分成熟體存在較大的差異(圖2)，如miR162、miR167、miR171、miR172、miR845這5個家族：miR162、miR167家族均存在2條成熟體，2條成熟體之間的差異較為明顯，但2條成熟體均能與其他物種的同一家族成熟體重疊；miR171、miR172，miR845這3個家族的成熟體與其他物種的miRNA成熟體存在著明顯的堿基差異(圖2)。說明了植物miRNA家族的保守性與特異性并存。

ath. 擬南芥；sbi. 高粱；osa. 水稻；bdi. 二穗短柄草；zma. 玉米；mtr. 苜蓿；ptc. 毛果楊；gma. 大豆；ctr. 柑橘；ccl. 克萊門柚；gra. 雷蒙德氏棉；csi. 甜橙；ghr. 棉花；aly. 琴葉擬南芥；ppt. 小立碗蘚；vvi. 葡萄；atr. 無油樟；mes. 木薯; A. miR159a；B. miR162a、162b；C. miR166a；D. miR167a、167b；E. miR168a；F. miR169a；G. miR171a；H. miR172a；I. miR396a；J. miR398a；K. miR535a；L. miR845a；M. miR2950-5p圖2 文心蘭miRNA家族成熟體序列比對分析ath. Arabidopsis thaliana; sbi. Sorghum bicolor; osa. Oryza sativa; bdi. Brachypodium distachyon; zma. Zea mays; mtr. Medicago truncatula; ptc. Populus trichocarpa; gma. Glycine max; ctr. Citrus trifoliata; ccl. Citrus clementina; gra. Gossypium raimondii; csi. Citrus sinensis; ghr. Gossypium hirsutum; aly. Arabidopsis lyrata; ppt. Physcomitrella patens; vvi. Vitis vinifera; atr. Amborella trichopoda; mes. Manihot esculentaFig.2 Analysis of mature sequences of miRNA family in O. hybridum

2.3 文心蘭25條pre-miRNAs二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)分析

本研究采用mfold在線軟件對文心蘭25條pre-miRNAs序列進行二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析。所研究的文心蘭pre-miRNAs序列長度偏長，因此，在本研究中，截取成熟體上下游各100 bp左右片段長度進行二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果(圖3)顯示，文心蘭pre-miRNAs折疊之后均能形成典型、復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但各個成員間的結(jié)構(gòu)存在差異。miR167-unigene0010899、miR167-unigene0011236中有2個小環(huán)，miR168-unigene0009958、miR172-unigene0006514中有3個小環(huán)，miR162-unigene0013441、miR162-unigene0040566、miR168-unigene0009959、miR396-unigene0011179、miR396-unigene 0019032、miR845-unigene0012489中有4個小環(huán)，miR162-unigene0003615、miR168-unigene 0004729、miR396-unigene0011180、miR398-unigene 0009665、miR398-unigene0009666、miR2950-unigene0006422中有6個小環(huán)，miR166-unigene 0011870、miR168-unigene0047942、miR169-unigene0022341、miR171-unigene0045985、miR535-unigene0009839、miR2950-unigene 0006151中有7個小環(huán)，miR159-unigene0037857中有8個小環(huán)，miR167-unigene0002619中有9個小環(huán)，miR535-unigene0012633中有10個小環(huán)。其序列的最小折疊自由能在-32.04～-120.98 kal/mol之間，在一定程度上，文心蘭pre-miRNAs序列的堿基數(shù)越多，折疊后最小自由能的負值越大，序列G/A比值、莖環(huán)數(shù)目等因素也可能影響著最小折疊自由能。

2.4 25條pre-miRNAs在文心蘭不同組織部位中的定量表達分析

為進一步探究文心蘭miRNA家族不同成員在文心蘭中的時空表達特性，本研究采用qRT-PCR技術(shù)檢測pre-miRNAs在‘南茜’文心蘭不同組織部位中的表達情況。結(jié)果(圖4)表明，除了miR162-unigene0040566、miR167-unigene0010899、miR168-unigene0004729、miR168- unigene0047942、miR168-unigene0009959、miR398-unigene0009665、miR535-unigene 0009839、miR535-unigene0012633這8個前體在文心蘭不同組織部位中不表達外，其余pre-miRNAs在文心蘭生長發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平存在著明顯的差異。主要可以分為以下3類：miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR172-unigene006514、miR396-unigene19032、miR398-unigene0009996、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等9個前體均在葉中大量表達，而在根中低表達；miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene 0011870、miR168-unigene0009958在根和葉中大量表達，在莖中低表達；而miR171-unigene 0045985、miR396-unigene-0011179、miR396-unigene0011180在根和莖中大量表達，在葉中低表達?？梢钥闯鰉iR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958和miR171-unigene0045985、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180在葉和莖中表達趨勢相反，提示它們在功能上可能存在互補性。miRNA各個家族在文心蘭生長發(fā)育過程中的表達模式各不相同，它們可能參與文心蘭不同器官生長發(fā)育過程的維持。

A. miR159-unigene0037857, dG=-33.6 kal/mol; B. miR162-unigene0003615, dG=-34.79 kal/mol; miR162-unigene 0013441, dG=-35.20 kal/mol; miR162-unigene0040566, dG=-67.00 kal/mol; C. miR166-unigene0011870, dG= -58.44 kal/mol; D. miR167-unigene0010899, dG=-62.10 kal/mol; miR167-unigene0011236, dG=-37.20 kal/mo; miR167-unigene 0002619, dG=-78.33 kal/mol; E. miR168-unigene0004729, dG=-49.16 kal/mol; miR168-unigene0047942, dG=-47.32 kal/ mol; miR168-unigene0009958, dG=-49.58 kal/mol; miR168-unigene0009959, dG=-50.50 kal/mol; F. miR169-unigene0022341, dG=-72.39 kal/mol; G. miR171-unigene0045985, dG=-44.76 kal/mol; H. miR172-unigene0006514, dG=-52.70 kal/mol; I. miRmiR396-unigene0011179, dG=-64.08 kal/mol; miR396-unigene0011180, dG=-70.56 kal/mol; miRmiR396-unigene 0019032, dG=-59.04 kal/mol; J. miR398-unigene0009665, dG=-32.04 kal/mol; miR398-unigene0009666, dG=-36.56 kal/mol; K. miR535-unigene0009839, dG=-56.10 kal/mol; miR535-unigene0012633, dG=-120.98 kal/mol; L. miR845-unigene 0012489, dG=-37.48 kal/mol; M. miR2950-unigene0006151, dG=-47.40 kal/mol; miR2950-unigene0006422, dG=-56.64 kal/mol圖3 文心蘭pre-miRNAs二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Hairpin structure analysis of pre-miRNAs sequences in O. hybridum

A. 植株；B. 葉；C. 假鱗莖；D. 根；E. pre-miRNAs家族表達聚類分析圖4 pre-miRNAs家族在文心蘭不同組織部位中的表達分析A. Plant; B. Leaves; C. Pseudobulb; D. Roots; E. Cluster analysis of pre-miRNAs family expressionFig.4 Expression analysis of pre-miRNAs family in different tissues of O. hybridum

A. 植株；B. 假鱗莖；C. 文心蘭pre-miRNAs家族表達聚類分析圖5 pre-miRNAs家族在文心蘭軟腐病菌侵染過程中的表達分析 A. Plant; B. Pseudobulb; C. Cluster analysis of pre-miRNA family expressionFig.5 Expression analysis of pre-miRNAs family in the soft rot pathogen infection of O. hybridum

2.5 25條pre-miRNAs在軟腐病菌侵染文心蘭假鱗莖中的定量表達分析

進一步選取長勢相近的健康文心蘭植株，以20 μL軟腐病菌液注射侵染，放置于溫度為35 ℃、80%濕度、20%光照的人工氣候箱培養(yǎng)12 h，注射軟腐病病菌0、4、8和12 h 后取假鱗莖部位，對文心蘭pre-miRNAs進行實時熒光定量分析。結(jié)果(圖5)表明，去除miR162-unigene0013441、miR167-unigene0010899、miR168-unigene0004729、miR168-unigene0009959、miR172-unigene0006514、miR398-unigene0009665、miR535-unigene0009839、miR535-unigene0012633、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422這10個不表達的前體外，其余pre-miRNAs在文心蘭軟腐病菌液侵染中的轉(zhuǎn)錄水平存在著明顯差異，并可以分3類：miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR396-unigene0011179、miR396-unigene 0011180、miR396-unigene0019032、miR845-unigene0012489的表達量在軟腐病菌侵染后呈現(xiàn)下降趨勢并在處理12 h后表達量達到最低；miR162-unigene0040566、miR168-unigene0009958、miR171-unigene0045985、miR166-unigene0011870在軟腐病菌液侵染4 h后其表達量升高，之后表達量下調(diào)，說明這4個miRNA可能在病菌侵染早期響應(yīng)軟腐病侵染過程；miR162-unigene0003615、miR167-unigene0002619、miR169-unigene 0022341、miR845-unigene0012489、miR168-unigene 0047942在菌液侵染過程中其表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，并在侵染8 h后表達量達到最低，提示上述4條miRNA可能通過下調(diào)表達而參與了軟腐病侵染過程。上述結(jié)果表明，不同家族的miRNA均在一定程度上參與了文心蘭軟腐病菌侵染過程，但其響應(yīng)方式與響應(yīng)時期則各不同，不同miRNA家族可能通過上調(diào)或下調(diào)表達參與菌液侵染過程，且不同家族的miRNA 均分散在各個時期出現(xiàn)明顯的上調(diào)或者下調(diào)表達，提示它們可能在軟腐病菌對文心蘭的侵染過程中具有功能上的互補性。

3 討 論

3.1 文心蘭pre-miRNAs和成熟體的進化特性

miRNA通過堿基互補原則切割靶基因mRNA[15-18]、介導(dǎo)DNA甲基化[19-21]、抑制翻譯[22-24]等方式在植物生長發(fā)育中起著調(diào)控功能[26]。植物miRNA的進化特性分析能在一定程度上闡明miRNA的功能。近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對于miRNA進化特性的研究已取得一定進展。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA家族一般在植物中呈現(xiàn)出保守性，如對miR159[27]、miR166[28]、miR171[29]家族的進化特性分析結(jié)果顯示植物這3個家族均具有較高的保守性。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA家族中，miRNA前體中非成熟序列存在較大差異，推測可能與物種在長期自然選擇過程中出現(xiàn)基因缺少或插入突變相關(guān)。例如，本研究中25條pre-miRNAs中提取出15條成熟序列，除了存在一個明顯的完全重疊區(qū)之外，其非成熟序列存在著實質(zhì)性差異，這有可能是文心蘭在長期自然選擇過程中突變積累并固定的結(jié)果。然而大多數(shù)miRNA家族的成熟體序列均具有較高的保守性，通過miRBase下載所有物種的miRNA成熟體序列并進行比對，發(fā)現(xiàn)miR159a、miR166a、miR168a、miR171a、miR172a、miR398a等家族的miRNA具有較高的物種間保守性。本研究從miRBase數(shù)據(jù)庫提取擬南芥、水稻、小麥、玉米、苜蓿、柑橘、甜橙等物種不同家族的miRNA成熟體序列與文心蘭不同家族成熟體進行比對分析，發(fā)現(xiàn)文心蘭miR159a、miR166a、miR168a、miR169a、miR396a、miR398a、miR535a、miR2950-5p等miRNA成熟體與其他物種間具有極高的序列相似性，推測這幾個miRNA家族可能具有較高的保守性；而miR162a、miR162b、miR167a、miR167b、miR171a、miR172a等miRNA成熟體物種間的保守性較低，推測部分miRNA家族可能存在物種間的特異性。

3.2 pre-miRNAs可能廣泛參與了文心蘭不同組織器官的生長發(fā)育過程

關(guān)于miRNA參與植物生長發(fā)育過程的研究已經(jīng)很多，不同miRNA家族在植物的生命周期中均發(fā)揮了不同的作用。如草莓miR159a和miR159b通過靶向MYB基因，參與了草莓花器官的生長[30]；擬南芥miR171c可通過抑制其靶基因SCL6的表達，最終抑制其腋芽的發(fā)育[31]；玉米miR172通過調(diào)控其靶基因gl15的表達，從而調(diào)控其葉片的發(fā)育[32]；龍眼中的pre-miR398b可能在龍眼體胚發(fā)生過程中參與了球形胚和子葉胚的發(fā)育過程[33]。在本研究中，以文心蘭不同組織部位根、莖、葉為材料，通過qRT-PCR方法對文心蘭25條pre-miRNAs 進行定量分析發(fā)現(xiàn)miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR172-unigene006514、miR396-unigene19032、miR398-unigene0009996、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等pre-miRNAs在葉片中大量累積可能有利于文心蘭葉的形態(tài)建成；miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene 0011870、miR168-unigene0009958等pre-miRNAs在根和葉中大量表達促進文心蘭葉和根的發(fā)育；而miR171-unigene 0045985、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180等pre-miRNAs同時在根和莖中大量表達可能利于其根和莖的發(fā)育。此外，miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958和miR171-unigene0045985、miR396-unigene00111 79、miR396- unigene0011180在葉和莖中表達趨勢相反，提示它們在功能上可能存在互補性。而miR162-unigene0040566、miR167-unigene0010899、miR168-unigene 0004729、miR168-unigene0047942、miR168-unigene0009959、miR398-unigene 0009665、miR535-unigene0009839、miR535-unigene 0012633等 8個pre-miRNAs在文心蘭不同組織部位中不表達，暗示其可能并未參與植物組織分化與形態(tài)建設(shè)等；miRNA各個家族在文心蘭生長發(fā)育過程中的表達模式各不相同，提示它們可能廣泛參與了文心蘭不同器官的生長發(fā)育過程。

3.3 文心蘭軟腐病侵染過程的不同階段可能由不同miRNA參與調(diào)控

miRNA在調(diào)控植物基因表達、生長發(fā)育和抵抗脅迫及病害等方面扮演著重要的角色，已有的研究表明miR171[34]、miR159[6]、miR393[5]等miRNA均在參與植物生物脅迫中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌的致瘤菌株可在植物的注射位置誘導(dǎo)miR393的表達，而非致瘤菌株則不會誘導(dǎo)[35]。miR393和miR167能夠抑制生長素信號通路，在根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)后的根瘤中，其表達水平明顯降低[5]。小麥白粉病葉片中克隆得到153個miRNA，其中24個與白粉病相關(guān)[36]。在擬南芥中過量表達蕪菁花葉病毒TuMV毒性蛋白基因，發(fā)現(xiàn)miR171表達水平降低，其靶基因表達水平上調(diào)，植物出現(xiàn)病毒病癥狀；另外，通過改造擬南芥miR159的前體獲得能夠靶向Hc-Pro的人造miRNA，過表達后發(fā)現(xiàn)，其抗病性增強[6]；病原菌脅迫誘導(dǎo)miR398表達下調(diào)進而導(dǎo)致其靶標(biāo)CSD過氧化物歧化酶基因上調(diào)表達，CSD基因在植物體內(nèi)大量富集從而激活其自身防御系統(tǒng)，產(chǎn)生系列的防衛(wèi)反應(yīng)并啟動抗氧化脅迫機制，最終抵抗病原菌入侵[7]。本研究以‘南茜’文心蘭不同組織部位為材料，通過qRT-PCR技術(shù)對pre-miRNAs在感病文心蘭假鱗莖的表達情況進行分析，結(jié)果顯示不同pre-miRNAs在文心蘭感病過程中的表達趨勢均有差異。miR162-unigene0013441、miR167-unigene0010899、miR168-unigene0004729、miR168-unigene0009959、miR172-unigene 0006514、miR398-unigene0009665、miR535-unigene0009839、miR535-unigene 0012633、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等10個pre-miRNAs在文心蘭軟腐病侵染過程中不表達，揭示其或許未能參與文心蘭植株軟腐病的應(yīng)激過程。miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR396-unigene 0011179、miR396-unigene0011180、miR396-unigene0019032、miR845-unigene00 12489的表達量在軟腐病菌侵染后呈現(xiàn)下降趨勢并在處理12 h后表達量達到最低，提示這6個pre-miRNAs可能通過下調(diào)miRNA的表達，進而導(dǎo)致其相應(yīng)靶標(biāo)基因的上調(diào)表達，最終參與了文心蘭的抗病過程。miR162-unigene0040566、miR168-unigene0009958、miR171- unigene 0045985、miR166-unigene0011870在軟腐病菌菌液侵染4 h后其表達量升高，之后表達量下調(diào)，說明這4個pre-miRNAs可能在軟腐病菌侵染早期響應(yīng)軟腐病侵染過程；miR162- unigene0003615、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR845-unigene0012 489、miR168-unigene 0047942在軟腐病菌菌液侵染過程中其表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在0 h時表達量最高，并在侵染8 h后表達量達到最低，提示上述4個pre-miRNAs可能通過下調(diào)表達而參與了軟腐病侵染過程，并在處理8 h后其響應(yīng)效果最明顯；而該研究將為探討文心蘭miRNA家族在文心蘭抗病過程中的作用提供一定參考依據(jù)。