王 瑜，王文麗，李 輝，劉 昊，滕瑞敏，莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，南京210095)

茶樹作為多年生常綠經(jīng)濟作物，在生長周期內(nèi)會受多種逆境的脅迫，如低溫、干旱、鹽漬、洪澇以及病蟲害等[1]。茶樹通過感知外界環(huán)境信號，并通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控相關(guān)基因的表達變化，從而調(diào)節(jié)自身的物質(zhì)代謝和生長發(fā)育等來適應(yīng)或抵御不良環(huán)境的影響，激素在植物逆境響應(yīng)中扮演重要的作用[2]。

BAP1(BON1-associated protein)是一種BON1相關(guān)蛋白，屬于C2超家族，含有典型的C2結(jié)構(gòu)域，此類蛋白大多是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，定位于細胞質(zhì)膜上[3]。C2功能域為Ca2+調(diào)節(jié)功能域，參與蛋白與蛋白互作，GTP酶的激活及蛋白質(zhì)磷酸化等過程，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細胞膜運動中起重要作用[4-7]。在植物中，胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，包括瞬間增加、持續(xù)變化或震蕩均能引起細胞內(nèi)信號的傳遞，這些過程需要大量Ca2+結(jié)合蛋白與下游信號通路相耦合[8-10]。在高等真核生物中，Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使，在響應(yīng)激素、光、氧化脅迫、干旱、極端溫度、病原體侵害等多種外源刺激時發(fā)揮重要影響[11-12]。如干旱脅迫能夠引起細胞質(zhì)基質(zhì)Ca2+濃度的變化，下游信號通路響應(yīng)Ca2+濃度變化引起一系列細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進而誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因的表達。

擬南芥(Arabidopsisthaliana)的BAP1是一個含C2結(jié)構(gòu)域的鈣依賴磷脂結(jié)合小蛋白，在植物體內(nèi)具有多種功能，低溫條件下可誘導(dǎo)植物細胞擴增和細胞分裂[13]；同樣含有C2保守功能域的BON1/CPN1蛋白能與其互作以共同負調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)[14]；過表達AtBAP1可抑制細胞的程序性死亡[15]。VvBAP1參與葡萄抵御低溫及鹽脅迫的過程，葡萄‘F-242’葉片經(jīng)低溫及NaCl處理后，其表達量均受誘導(dǎo)升高[16]。植物中，BAP1參與植物響應(yīng)逆境脅迫的過程，目前茶樹中CsBAP1基因的功能與作用機制尚不清楚。

本研究選取茶樹‘龍井43’為材料，克隆獲得茶樹CsBAP1基因，并進行了序列比對、理化性質(zhì)和三級結(jié)構(gòu)等方面的分析。利用熒光定量PCR技術(shù)，研究了CsBAP1基因在茶樹‘龍井43’的不同組織中以及非生物和激素脅迫下的表達模式，為進一步研究BAP1基因在茶樹中的生物學(xué)功能提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試茶樹材料為‘龍井43’(Camelliasinensiscv.‘Longjing 43’)兩年生扦插盆栽幼苗，來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所。取‘龍井43’幼嫩葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為克隆CsBAP1基因的模板。

對生長良好、大小一致的茶樹葉片分別噴施脫落酸(0.1 mmol·L-1ABA)、茉莉酸甲酯(1 mmol·L-1MeJA)、吲哚乙酸(1 mmol·L-1IAA)、赤霉素(1 mmol·L-1GA3)和水楊酸(1 mmol·L-1SA)，處理2 h后取樣，以未處理的植株作為對照。此外對自然生長狀態(tài)下的植株進行非生物脅迫處理，高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、干旱(200 g·L-1PEG)、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)分別處理0、2、4、8和24 h后取樣?！埦?3’茶樹的花蕾、花、幼葉、成熟葉和老葉作為不同組織基因表達材料。對上述所取得的樣品，進行RNA提取和cDNA合成，用于實時熒光定量的模板。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取和cDNA合成茶樹材料的總RNA按照Quick RNA Isolation Kit(北京華越洋公司)試劑盒說明書來提取。RNA樣品濃度利用Nanodrop ND 1000(上海譜元儀器有限公司)微量紫外分光光度計檢測， RNA質(zhì)量用1.2%凝膠電泳檢測。參照Prime Script RT reagent Kit(大連TaKaRa公司)試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2茶樹CsBAP1基因克隆基于本課題組茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[17]，設(shè)計1對特異引物CsBAP1-QF(5′-ATGGCAACAACATCACGA-3′)和CsBAP1-QR(5′-TCAGTAATACCTAG ACCAAACC-3′)。擴增體系采用：10 μL 2×TaqPlus Master Mix酶、7 μL ddH2O、1 μL模板、CsBAP1-F/R引物各1 μL，共20 μL體系。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物并連接至pMD19-T載體，隨即轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞。抽提質(zhì)粒后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 6.0軟件完成氨基酸序列的多重比對和親疏水性分析。利用在線工具包ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)和(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms)分析氨基酸的組成以及理化性質(zhì)。選擇MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。利用在線軟件NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)分析磷酸化位點。氨基酸序列折疊無序化分析利用在線網(wǎng)站FoldIndex(https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex)。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測在SOPMA網(wǎng)站(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)上進行。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型利用Swiss-Model(http://www.Swissmodel.expasy.org)構(gòu)建。利用Microsoft Excel 2010軟件制作完成熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

1.2.4茶樹CsBAP1基因的表達特性分析按照SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)的操作說明進行實時熒光定量PCR。CFX96TMreal-time PCR system作為熒光定量PCR平臺。CsBAP1檢測引物CsBAP1-qrtF(5′-ACTTCGCCGGAGGTTACTTT-3′)和CsBAP1-qrtR(5′-GGA-GACAATCCCACCAGAAA-3′)。選擇茶樹GAPDH作為內(nèi)參基因[18]，引物分別為CsGAPDH-JF(5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′)和CsGAPDH-JR(5′-CAGTGGGAACACGGAAA-GC-3′)，采用2-ΔΔCT方法進行相對定量計算[19]。

2 實驗結(jié)果

2.1 茶樹CsBAP1基因的克隆

選擇生長健康、正常、無病蟲侵害的‘龍井43’扦插幼苗嫩葉的cDNA作為模板。以CsBAP1-QF和CsBAP1-QR為引物對模板進行PCR擴增，得到擴增片段約500 bp。序列測定分析結(jié)果表明，茶樹CsBAP1開放閱讀框長度為543 bp，共編碼180個氨基酸(圖1)。

2.2 茶樹CsBAP1蛋白氨基酸序列比對

茶樹CsBAP1保守域預(yù)測(圖3，A)結(jié)果顯示，CsBAP1蛋白在7～127個氨基酸位點之間，含有一個Ca2+依賴性膜結(jié)合位點的C2功能結(jié)構(gòu)域，屬于C2-SRC2-like亞家族。將茶樹CsBAP1同擬南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄(Vitisvinifera)、碧桃(Prunuspersica)等的BAP1氨基酸序列進行多重序列比對，結(jié)果(圖3，B)顯示一致性達50.50%，且上述物種均有C2結(jié)構(gòu)域。

2.3 茶樹CsBAP1進化樹分析

為了進一步探究茶樹CsBAP1蛋白與其他物種的進化關(guān)系，對其進行Blastx同源檢索與比對，得到不同物種間與其相似程度較高的BAP1蛋白氨基酸序列，選用擬南芥、葡萄、碧桃等共13個物種，與茶樹CsBAP1蛋白構(gòu)建進化樹關(guān)系圖(圖2)。結(jié)果顯示：茶樹CsBAP1蛋白與芝麻、葡萄等物種親緣關(guān)系較近，與番木瓜、野生大豆等物種的親緣關(guān)系較遠。

圖1 茶樹CsBAP1核苷酸序列與推測的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and amino acid sequences of CsBAP1 from tea plant

圖2 茶樹CsBAP1蛋白的進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of tea plant CsBAP1 protein

圖3 茶樹CsBAP1蛋白的保守域(A)與其他物種氨基酸序列的多重比對(B)Fig.3 The conserved domains of CsBAP1 protein (A) and multiple alignment of relative amino acid sequences in C. sinensis and other species (B)

2.4 茶樹CsBAP1蛋白氨基酸的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam[20]對CsBAP1蛋白的組成成分和理化性質(zhì)進行分析(表1)。結(jié)果顯示上述植物的BAP1蛋白氨基酸殘基數(shù)在165～192之間。相對分子量為17.77～21.99 kD。理論等電點在8.4～9.7之間。酸性氨基酸的平均含量為17%，堿性氨基酸的平均含量為14%，脂肪族氨基酸明顯高于芳香族氨基酸，平均含量分別為21%和8%。各個物種之間的理化性質(zhì)較為相似。主要平均疏水特性(grand average of hydropathicity)在-0.32左右，表現(xiàn)出明顯的親水性。利用在線軟件NetPhos分析對CsBAP1蛋白的磷酸化位點預(yù)測顯示，在CsBAP1中含有24個絲氨酸(Ser，S)磷酸化位點，9個蘇氨酸(Thr，T)磷酸化位點，1個酪氨酸(Tyr，Y)磷酸化位點。

2.5 茶樹CsBAP1蛋白推導(dǎo)的氨基酸親/疏水性及無序化結(jié)構(gòu)分析

CsBAP1基因推導(dǎo)的氨基酸序列親水性/疏水性分析是借助DNAMAN 6.0軟件完成的。結(jié)果顯示(圖4)，該蛋白疏水性最強的位點是在第31位的苯丙氨酸(Phe)；親水性最強的位點是117與118位的絲氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)。總平均疏水性為負值，表明CsBAP1蛋白屬于親水性蛋白。利用FoldIndex程序?qū)Σ铇銫sBAP1蛋白氨基酸序列進行折疊的無序化分析。如圖5所示，CsBAP1不存在無序化區(qū)域。

表1 不同植物中BAP1氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

圖4 茶樹 CsBAP1氨基酸序列的疏水性和親水性分析Fig.4 Analysis on hydrophobicity and hydrophilicity of amino acid sequence of CsBAP1 in C. sinensis

圖5 茶樹CsBAP1折疊狀態(tài)的分析Fig.5 Analysis of the folding state of CsBAP1 in C. sinensis

2.6 茶樹CsBAP1蛋白推導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

為了對CsBAP1蛋白進行進一步的分析，利用SOPMA網(wǎng)站對茶樹CsBAP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析。結(jié)果顯示(圖6)：CsBAP1含有8.89%的α-螺旋(α-helix)，7.78%的β-轉(zhuǎn)角(β-turn)，47.78%的隨機卷曲(random coil)和35.56%的β-折疊(extended strand)。CsBAP1主要組成部分為隨機卷曲和β-折疊。利用Swiss-Model軟件預(yù)測對CsBAP1三級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖7，其N端由丙氨酸開始，有一個C2結(jié)構(gòu)域，占全序列的67%。其三維結(jié)構(gòu)中隨機卷曲占了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的大部分區(qū)域，α-螺旋同β-轉(zhuǎn)角分散其中，結(jié)構(gòu)推測與二級結(jié)構(gòu)吻合。

藍色：α-螺旋；紅色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角；粉色：不規(guī)則卷曲圖6 茶樹CsBAP1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Blue: Alpha helix, Red: Extended strand, Green: Beta turn, Pink: Random coilFig.6 The secondary structure of CsBAP1 in C. sinensis

圖7 茶樹CsBAP1三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 The three-dimension structure of CsBAP1 in C. sinensis

2.7 茶樹CsBAP1基因在不同組織中的表達

為分析CsBAP1表達的組織特異性，以茶樹‘龍井43’為實驗材料，采用實時熒光定量PCR方法檢測了CsBAP1基因在不同組織中的表達(圖8)。結(jié)果表明，CsBAP1基因在茶樹不同組織中均有表達，表達量從高到低依次為老葉>花>花蕾>幼葉>成熟葉，其中花和花蕾的表達量較為接近，幼葉和成熟葉的表達量較為接近，老葉的表達量顯著高于其他組織的表達量。茶樹CsBAP1在老葉中的表達量分別是花、花蕾、幼葉和成熟葉的3.3、3.4、19.3和23.8倍。

不同小寫字母表示不同組織間的差異顯著(P<0.05)圖8 CsBAP1基因在茶樹不同組織中的表達Different letters represent significant differences among different tissues (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of CsBAP1 gene in different tissues of C. sinensis

2.8 茶樹CsBAP1基因在不同激素處理下的表達情況

為了研究CsBAP1基因在不同激素誘導(dǎo)下的表達情況，分別用SA、GA3、MeJA、ABA和IAA共5種激素處理茶樹，處理時間為2 h。結(jié)果顯示(圖9)，在不同激素處理下，CsBAP1的表達量與對照相比均表現(xiàn)出了不同程度的下調(diào)，表達水平從高到低依次為SA>MeJA>GA3>IAA>ABA。在對照中的表達量分別是SA、MeJA、GA3、IAA和ABA的5.9、14.9、18.9、21.8及26.7倍。結(jié)果表明，不同激素處理都會抑制CsBAP1基因的表達。

不同小寫字母表示不同處理間的差異顯著(P<0.05)圖9 不同激素處理下CsBAP1基因在茶樹中的表達Different letters represent significant differences among different treatments (P<0.05)Fig.9 Expression analysis of CsBAP1 gene under different hormonal treatments of C. sinensis

不同小寫字母表示同一處理不同時間的差異顯著(P<0.05)圖10 不同環(huán)境因子脅迫下CsBAP1基因在茶樹中的表達Different letters represent significant differences among different times with same treatment (P<0.05)Fig.10 Expression analysis of CsBAP1 gene under different stress treatments

2.9 茶樹中CsBAP1基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)特征

茶樹在高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)和干旱(200 g·L-1PEG)4種逆境脅迫處理下，CsBAP1的表達量較對照均表現(xiàn)出一定程度的上調(diào)(圖10)，基本趨勢表現(xiàn)為其表達量在短時間內(nèi)達到一個峰值，然后逐漸下降，隨著時間的延長再重新回升。高溫處理下，CsBAP1的表達量在4 h時最高，為對照的68.8倍，處理2、8、24 h時表達量分別為對照的24.4、18.0、39.1倍。低溫處理下，2 h時其表達量顯著上調(diào)，為對照的14.7倍，4和8 h時表達量有所降低，但仍高于對照，24 h時表達量達到最高，為對照的24.0倍。鹽處理下，該基因的表達模式與高溫較為相似，脅迫處理2、4、8、24 h，茶樹葉片中CsBAP1的表達量分別為對照的13.5、27.1、4.0、13.1倍。干旱脅迫下，處理2、4、8 h，CsBAP1的表達量呈穩(wěn)定的上調(diào)趨勢，分別為對照的13.3、6.5、9.7倍，處理24 h時達到最大值，為對照的37.9倍。

3 討 論

本研究從茶樹‘龍井43’中克隆了茶樹CsBAP1基因的cDNA，其開放閱讀框為543 bp，編碼180個氨基酸。理化性質(zhì)分析表明，CsBAP1的序列長度、分子質(zhì)量及等電點等均與其他物種的BAP1相近；該基因含有一個保守的鈣依賴性膜脂結(jié)合位點C2結(jié)構(gòu)域，屬于C2-SRC2-like亞家族，此亞家族中的很多成員在非生物脅迫和防御應(yīng)答中起重要作用[21-23]。

基因的表達情況與基因的實際功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的BAP1蛋白在植物體內(nèi)有多種功能，如負調(diào)控植物的防御反應(yīng)，過表達的BAP1增加了擬南芥對真菌的易感性，抑制植物細胞的程序性死亡[13-15]。CsBAP1在茶樹的幼葉、成熟葉、老葉、花和花蕾中均有表達，其中在老葉中的表達量最高，而在幼葉及成熟葉中的表達量較低。在茶樹中，CsBAP1基因可能參與調(diào)控植物體細胞的衰老甚至死亡的過程。此外，該基因在花和花蕾中的也有較高的表達量，花的發(fā)育受多個信號分子的協(xié)同調(diào)控，鈣離子在其中發(fā)揮著重要作用[24]。Ca2+是一種重要的第二信使，它能通過外界的多種生物或非生物信息介導(dǎo)細胞內(nèi)基因表達以及細胞生理反應(yīng)的調(diào)控，表明該基因是以一種Ca2+依賴的方式在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

許多研究表明，C2結(jié)構(gòu)域蛋白在調(diào)節(jié)植物抵抗干旱、高鹽、低溫、病原菌侵害等生物和非生物脅迫中行使功能。如水稻中的OsERG1a和OsEGG1b在水稻細胞受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)后，能以Ca2+依賴的方式參與防御反應(yīng)和膜運轉(zhuǎn)[25]；大麥中的HvC2d響應(yīng)重金屬脅迫，并與葉片衰老有關(guān)[26]；OsGAP1是水稻抗鹽和抗細菌性病原菌的一個調(diào)控因子[27]；水稻OsSMCP1在擬南芥中的過表達可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株抵抗生物和非生物脅迫[28]；VrPLC3對辣椒抗鹽和抗旱具有正調(diào)控作用[29]。為驗證CsBAP1基因?qū)Σ铇淠湍嫘缘淖饔脵C制，本實驗研究了該基因在高溫、低溫、NaCl和PEG脅迫下的表達特性，結(jié)果表明，CsBAP1在不同脅迫下均受誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達，進一步說明了CsBAP1基因廣泛參與對非生物脅迫的應(yīng)答并在其中發(fā)揮了重要功能。在高、低溫，鹽害及干旱脅迫下，植物生長因滲透和氧化脅迫而受到嚴重抑制。在此過程中，其他信號分子(如ROS和Ca2+)作為第二信使在C2結(jié)構(gòu)域蛋白對植物的生物和非生物脅迫反應(yīng)中也起著重要的調(diào)控作用[6-7]。由此可以推斷，CsBAP1可能參與調(diào)控植物逆境脅迫應(yīng)答的信號傳導(dǎo)。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是在細胞信號傳遞過程中起著重要作用的一種調(diào)節(jié)方式，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是蛋白質(zhì)磷酸化修飾的3種主要的部位[30]。蛋白質(zhì)磷酸化預(yù)測軟件分析表明，CsBAP1含有多個絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點。脅迫條件尤其是干旱、高低溫和鹽害會導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度升高[31]，起始一系列蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)MAPK(mitogen-activated protein kinase)，最終激活一些對細胞具有保護作用的蛋白以及一些控制應(yīng)激調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。這些應(yīng)激調(diào)節(jié)基因編碼的蛋白往往參與產(chǎn)生一些植物激素，如ABA、茉莉酸和水楊酸等，而這些植物激素能夠起始植物體內(nèi)第二輪的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，再次引發(fā)植物體內(nèi)Ca2+水平的變化[10,32-33]。本研究中的CsBAP1基因受ABA、IAA、SA、GA3、MeJA的誘導(dǎo)后，其表達量均受到不同程度的抑制，且與對照相比具有顯著差異。CsBAP1基因?qū)Φ蜏亍⒏邷?、高鹽、干旱脅迫均有響應(yīng)，說明了逆境脅迫可導(dǎo)致CsBAP1轉(zhuǎn)錄水平的上升。外源激素處理引起植物體內(nèi)Ca2+震蕩，這些激素和Ca2+可能以一種協(xié)同作用有效抑制CsBAP1轉(zhuǎn)錄水平的增加，從而有助于在逆境脅迫過程中穩(wěn)定該基因的水平。由于植物激素對植物的作用機理和作用過程復(fù)雜，其在茶樹中的調(diào)控機制仍待進一步研究。

本研究首次在茶樹中克隆CsBAP1基因并分析了其在不同組織，不同激素和不同逆境處理下的表達情況，初步推測其在茶樹的細胞程序性死亡過程及鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。CsBAP1對茶樹生長發(fā)育過程中的逆境脅迫響應(yīng)表達為后續(xù)研究該基因參與茶樹生長發(fā)育提供了理論參考。但其具體的功能以及其可能的作用機制，仍需進一步的驗證。