吳小婷，邵帥旭，任海波，李 林，侯喜林，劉同坤

(南京農(nóng)業(yè)大學 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，南京 210095)

白菜(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisMakino)是中國重要的蔬菜作物，在長江中下游地區(qū)廣泛種植[1]，春季栽培白菜往往因為“早期抽薹”而不能獲得正常的產(chǎn)品，直接影響產(chǎn)量與品質(zhì)，給生產(chǎn)帶來較大損失[2]。因此培育優(yōu)良的適宜春季栽培的晚抽薹白菜品種，是解決這一問題的有效途徑[3]。

由營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段轉(zhuǎn)換是高等植物生命活動中的一個重要過程，這個過程一般稱為開花，開花受內(nèi)部遺傳和外界環(huán)境因素兩方面的共同影響[4]。白菜類作物與模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)同屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，因此擬南芥開花途徑的分子機制研究結(jié)果對白菜類作物開花方面的研究有較大借鑒意義。近年來利用分子遺傳學方法對擬南芥開花突變體進行研究表明開花存在四條主要的途徑：光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernalization pathway)、赤霉素途徑(GA pathway)和自主途徑(autonomous pathway)。其中春化途徑是指植物通過適當強度的冷處理誘導抑制開花基因的沉默，從而使植物具備開花能力[5]。春化過程中由許多特異性基因按照一定的順序進行表達來控制，各種基因相互聯(lián)系相互制約，在擬南芥中春化對開花的促進作用主要是通過春化對FLC(FLOWERINGLOCUSC)表達的抑制來實現(xiàn)的[6]。FLC是一個開花抑制基因，編碼一個MADS-box轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。春化過程中低溫影響其表達水平，溫度對其活性的調(diào)控貫穿于植株的整個生長發(fā)育過程[7]。

MAF2是調(diào)控開花時間的關(guān)鍵基因，對擬南芥開花具有抑制作用[8]，MAF2基因編碼一個MADS-box蛋白，同時在擬南芥中是MADS-AFFECTINGFLOWERING3～5(MAF3、MAF4和MAF5)組成串聯(lián)陣列，這些基因與FLC同源[9]。FLC基因在擬南芥中是春化途徑的關(guān)鍵抑制因子。研究顯示：在擬南芥中，春化路徑中的抽薹開花時間是由FLC以及控制FLC表達的FRI(FRIGIDA)等位基因來調(diào)控的[10]。FLC基因與MAF2基因在影響開化過程中具有相似性[11]。所以推測BcMAF2基因在影響白菜開花的過程中也是作為抑制開花的關(guān)鍵因子而存在的。

為了研究BcMAF2基因在白菜開花中的功能，本研究利用同源克隆的方法獲得了BcMAF2基因片段，克隆這個基因全長cDNA序列，對BcMAF2基因進行了亞細胞定位分析，同時，將BcMAF2導入擬南芥中進行轉(zhuǎn)基因功能驗證，確定BcMAF2基因在植物開花過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

不結(jié)球白菜晚抽薹品種NHCC004保存于南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，種植在人工氣候室中，在22 ℃ 16 h光照，18 ℃ 8 h黑暗條件下培養(yǎng)。取5葉期的葉片作為實驗材料，用液氮將取完的樣品立即速凍然后貯存于-80 ℃冰箱中待用。

1.2 方 法

1.2.1RNA的提取和cDNA合成取適量葉片在液氮中研磨，根據(jù)植物總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)的方法提取總RNA。按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法將提取的 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書來選擇反轉(zhuǎn)錄的反應條件及程序。

1.2.2白菜BcMAF2基因全長的克隆從白菜數(shù)據(jù)庫中查找擬南芥MAF2同源序列，并在其上設計1對基因特異引物BcMAF2-F1(5′-ATGGGGAGAAGAAAAGTAGA-3′)和BcMAF2-R1(5′-TTACTTGAGCAGCGGGAGAG-3′)。以不結(jié)球白菜NHCC004葉片的cDNA作為模板，總體系20 μL進行擴增。PCR反應體系如下：濃度為2 μg·L-1RNA的cDNA 1.0 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，10×LA Taq Buffer 2.0 μL，LA Taq 聚合酶0.5 μL，1 mmol · L-1dNTP 1.0 μL，超純水13.5 μL。反應程序為：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，并進行35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃反應10 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，切膠并回收條帶大小正確的目的片段。16 ℃過夜連接到pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落進行鑒定后，送往南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.3序列分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載不同物種MAF2的基因及氨基酸序列；運用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行比對；運用MEGA 5軟件對系統(tǒng)進化樹進行分析。

1.2.4Gateway技術(shù)載體構(gòu)建(1)BcMAF2基因片段的PCR擴增。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建BcMAF2載體[12]。首先構(gòu)建Gateway入門載體，將attB1和attB2位點序列分別加在正向引物和反向引物兩端，設計BcMAF2的引物BcMAF2-F2(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-TCATGGGGAGAAGAAAAGTAGA-3′)及BcMAF2-R2(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAA-AGCTGGGTCTTACTGCAGCGGGAGAGTTT-3′)。使用Phusion超保真酶進行PCR擴增，其反應程序如下：98 ℃預變性30 s， 98 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃反應10 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后將大小正確的PCR產(chǎn)物切膠回收。

(2) BP反應。將切膠回收的PCR產(chǎn)物與入門載體pdonr221進行BP反應?？偡磻w系5 μL，具體反應體系如下：PCR回收產(chǎn)物2.7 μL，入門載體1.0 μL， 5×BP反應緩沖液1.0 μL，BP酶混合物0.3 μL。瞬時離心后25 ℃反應4 h，反應結(jié)束后加入濃度為100 μmol·L-11.0 μL蛋白酶K溶液，37 ℃反應10 min。將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，均勻涂布于含50 mg·L-1卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆用含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后進行PCR檢測，將片段大小正確的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒即重組入門載體pdonr221-BcMAF2。

1.2.5BcMAF2亞細胞定位與轉(zhuǎn)基因功能驗證載體構(gòu)建由于入門載體pdonr221和目的載體pEarleyGate101篩選的抗性基因一致，因此先用限制性內(nèi)切酶MluI在LR反應前對BP反應得到的入門載體進行單酶切，酶切之后將片段大小正確的片段切膠回收，然后與目的載體進行LR反應?？偡磻w系5 μL，具體反應體系如下：線性化的入門載體pdonr221-BcMAF2 3 μL，目的載體pEarleyGate101 1 μL，LR酶混合物1 μL。瞬時離心后25 ℃反應4 h，反應結(jié)束后加入濃度為100 μmol·L-11.0 μL蛋白酶K溶液，37 ℃反應10 min。將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，均勻涂布于含50 mg·L-1卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆用含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后進行PCR檢測，將片段大小正確的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒即重組目的載體pEarleyGate101-BcMAF2-YFP-HA。

1.2.6BcMAF2亞細胞定位分析將構(gòu)建好的重組融合表達載體pEarleyGate101-BcMAF2-YFP-HA利用液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，均勻涂布于含50 mg·L-1卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆用含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)后進行PCR檢測。將檢測正確的含有融合表達載體的GV3101農(nóng)桿菌在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)20 h，然后取1%體積的菌液到同樣的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至菌液OD600為1.0。在4 000 r·min-1下離心5 min后用最終濃度為10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES(調(diào)節(jié)pH 5.7)，150 μmol·L-1乙酰丁香酮的注射緩沖液重懸至OD600為0.8，室溫放置5 h后，用1 mL的無針頭注射器將含有重組融合表達載體的農(nóng)桿菌菌液注射至煙草葉片，用H2B-RFP標記細胞核所在位置。注射后的煙草植株置于22 ℃的16 h光照，18 ℃的8 h黑暗的人工氣候室中進行培養(yǎng)3 d后。在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，進行BcMAF2蛋白的亞細胞定位分析。

1.2.7BcMAF2基因?qū)霐M南芥將檢測正確含有融合表達載體pEarleyGate101-BcMAF2-YFP-HA的農(nóng)桿菌接種于4 mL 濃度各為50 mg·L-1利福平和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到20 mL相同的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，200 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)12 h至OD600為1.5。5 000 r·min-1下4 ℃離心10 min，棄上清后用滲透緩沖液重懸到OD600為0.8。將擬南芥的花薹浸入菌液中攪動5 s用吸水紙擦干，侵染后的擬南芥植株置于22 ℃ 16 h光照，18 ℃ 8 h黑暗的人工氣候室中進行培養(yǎng)。收到種子后進行播種，培育，在種子發(fā)芽繼續(xù)生長3周后噴施0.3%草甘膦溶液進行篩選。約2周后對存活擬南芥進行PCR檢測，選出陽性植株即為T0代，收種后繼續(xù)培育篩選。

1.2.8Westernblot驗證從T2代中選取10株生長旺盛的擬南芥植株提取蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離，通過濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)完后用1×麗春紅染液在脫色搖床上將膜染色5 min，然后用水將膜沖洗2～3次至看到膜上的蛋白。用含有5%脫脂奶粉的封閉液在室溫下將膜搖動封閉30 min。將α-HA抗體(Biorad, USA)用含有5%脫脂奶粉封閉液稀釋濃度為1∶2 000，室溫下孵育2 h后在脫色搖床上用TBST重復洗3次，每次10 min。將膜與底物Pico反應5 min后去盡殘液，包好，放入化學發(fā)光儀中檢測BcMAF2蛋白在擬南芥植株中的表達。

1.2.9開花時間分析選取其中BcMAF2蛋白成功表達的植株收種后進行培養(yǎng)并以野生型擬南芥植株做對照，在每個株系中選取10株生長旺盛的擬南芥植株進行開花時間分析，并分別統(tǒng)計每株擬南芥抽薹時蓮座的葉片數(shù)，計算平均值，并通過Excel軟件制成柱狀圖進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BcMAF2的克隆和序列分析

以白菜cDNA為模板，設計全長引物進行擴增，獲得了1個與預期大小一致的片段(圖1)。序列測定與分析表明，白菜BcMAF2 基因含有1個588 bp開放閱讀框(ORF)，編碼 196 個氨基酸。

2.2 BcMAF2氨基酸同源性與進化樹分析

利用 BLASTp 對BcMAF2基因編碼的氨基酸同源性進行檢索，從NCBI中下載9個其他物種的MAF2蛋白序列，并用DNAMAN軟件對所得的序列進行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示(圖2)，該蛋白與蕪菁(Brassicarapa)、歐洲油菜(Brassicanapu)、羽衣甘藍(Brassicaoleracea)及蘿卜(Raphanussativus)相似性高達100%、93%、93%及95%，與黃花亭薺(Arabisalpine)、薺藍(Camelinasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、天藍遏藍菜(Noccaeacaerulescen)及彎曲碎米薺(Cardamineflexuosa)相似性相對較低，分別為75%、74%、71%、74%及63%。同時，利用 MEGA5將白菜BcMAF2蛋白與其他植物的MAF2蛋白進行同源進化分析并構(gòu)建進化樹，結(jié)果(圖3)表明，白菜BcMAF2蛋白與蕪菁，歐洲油菜及羽衣甘藍為同一分支，并且BcMAF2與蕪菁聚為一支，親緣關(guān)系最高。

2.3 白菜BcMAF2蛋白亞細胞定位

將含有pEarleyGate101-BcMAF2-YFP-HA的農(nóng)桿菌侵染煙草植株48 h后，觀察本氏煙葉片中的熒光。結(jié)果見圖4，在激光共聚焦顯微鏡下，試驗組pEarleyGate101-BcMAF2-YFP-HA在YFP激發(fā)光下可以檢測到較為明顯的黃色熒光信號，紅色熒光信號表示本氏煙草植株細胞核位置；2張熒光信號重疊表明BcMAF2蛋白定位于細胞核。

圖1 BcMAF2基因PCR擴增產(chǎn)物M.1kb ladder plus M1191 marker；1.BcMAF2Fig.1 PCR amplified product of BcMAF2 gene

圖2 白菜與其他物種MAF2同源氨基酸序列比對Fig.2 The alignment of amino acids of MAF2 from Brassica campestris and other plants

圖3 白菜MAF2蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogentic tree analysis of MAF2 proteins

2.4 Western blot分析

本實驗使用Western blot驗證BcMAF2基因是否在擬南芥植株中表達，試驗中使用野生型擬南芥作為對照，如圖5，A，分別在選取的第1、4、5、8和10株觀察到BcMAF2蛋白印跡，表明T2代擬南芥植株中BcMAF2基因在上述5個株系中表達成功。

2.5 開花時間分析

為了重點研究在BcMAF2基因表達量較高背景下的開花時間變化情況，本試驗僅收取第8、10株擬南芥種子進行培育并選取野生型擬南芥作對照，每個株系分別選取10株進行統(tǒng)計，以抽薹時的蓮座葉數(shù)量作為判斷開花時間早晚的依據(jù)。如圖5，B， 野生型擬南芥在長出8～9片蓮座葉后抽薹開花，而轉(zhuǎn)基因植株在抽薹時的蓮座葉數(shù)量是野生型對照的3～4倍，野生型與轉(zhuǎn)基因植株的開花時間具有顯著性差異。相對于野生型，轉(zhuǎn)基因植株開花較遲，蓮座更加膨大(圖5，C)。

A～D為BcMAF2在煙草中的定位情況。A. 黃色熒光通道；B. 紅色熒光通道；C. 明場；D.疊加圖; 標尺=50 μm圖4 BcMAF2在本氏煙葉片細胞中的定位A-D. Nicotiana tabacum cells were transformed with BcMAF2; A. YFP; B. RFP; C. Bright field; D. Merge; Bar=50 μmFig.4 Subcellular localization of BcMAF2 in leaves of Nicotiana tabacum

A.Western blot驗證； B.擬南芥抽薹時葉片數(shù)統(tǒng)計，不同小寫字母表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照抽薹時葉片數(shù)量差異顯著(P<0.05)； C.擬南芥抽薹時野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株生長狀態(tài)對比圖5 western blot檢測與開花時間分析A.Western blot； B.Statistics of leaf number in Arabidopsis bolting，different normal letters indicate significant difference in rosette leaf number between transgenic plants and wild-type； C.Comparison of growth status between wild-type plants and transgenic plants in Arabidopsis boltingFig.5 Western blot analysis and flowering time analysis

3 討 論

白菜屬十字花科蕓薹屬[13]，絕大多數(shù)屬于二年生冬性蔬菜作物，具有適應性廣、生長期短、高產(chǎn)、營養(yǎng)豐富等特點，是居民生活中消費比例較大的蔬菜品種[14]。白菜的早期抽薹是影響品質(zhì)發(fā)育的一個重要問題，培育耐抽薹白菜品種是解決這一問題的關(guān)鍵途徑。春化反應是影響植株抽薹開花的重要途徑[15]，需多個基因共同參與，相互聯(lián)系[16]。遺傳和分子分析表明位于擬南芥5號染色體的FLC基因在擬南芥中是春化反應的主要決定因子[11,17]，然而，flc突變體仍然響應春化的事實表明仍有其他基因參與維持春化反應[18]。MAF2作為FLC基因的旁系同源基因與MAF3、MAF4、MAF5串聯(lián)排列在擬南芥5號染色體底部，鑒于FLC與MAF2至MAF5的相關(guān)性，這些基因可能也參與了春化的調(diào)控過程[13]。

FLC與MAF2在植物開花過程中通過抑制FT和SOC等開花促進因子的表達來發(fā)揮負調(diào)控作用[8]，在擬南芥中春化作用會抑制FLC的轉(zhuǎn)錄與表達過程，導致提前開花，抑制的程度與低溫處理的時間相關(guān)，低溫處理的時間越長，F(xiàn)LC的表達越弱[19]。MAF2在春化過程中對溫度的調(diào)控不敏感，其抑制因子的活性在FLC下游發(fā)揮作用，可以修正因短暫低溫引起的FLC表達水平降低，防止低溫引起擬南芥發(fā)生春化而提前開花[20]。由此分析并大膽推測MAF2基因在白菜中也是保守的，在白菜中MAF2基因也可能通過修正FLC表達水平的降低，進而解除低溫對FLC表達的限制，達到白菜晚抽薹開花的目的。

擬南芥中，F(xiàn)LC的表達水平顯示春化反應的分子基礎(chǔ)[21]，且擬南芥maf2突變體在寒冷環(huán)境中早開花與FLC轉(zhuǎn)錄水平的下降沒有聯(lián)系，同時35S::MAF2植株在長時間的寒冷環(huán)境中伴隨著FLC轉(zhuǎn)錄水平的降低仍保持晚開花，說明在春化途徑中MAF2可以獨立調(diào)控開花或者在FLC轉(zhuǎn)錄因子的下游進行調(diào)控[16]，表明擬南芥MAF2可以防止在春化過程中因為遭遇短暫的低溫導致FLC水平的降低而引起的提前開花，但是目前在白菜中尚未發(fā)現(xiàn)MAF2的進一步研究。本實驗中為了驗證BcMAF2基因的功能，采用同源克隆方法首次從白菜中克隆到MAF2基因，并對其進行了初步分析，BcMAF2編碼區(qū)為588 bp，編碼了196個氨基酸，利用亞細胞定位確定白菜BcMAF2基因位于植物細胞核內(nèi)，這與該基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能、編碼蛋白的功能性質(zhì)有關(guān)。將BcMAF2導入擬南芥中，觀察到種植在相同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株相對于野生型擬南芥更晚開花，轉(zhuǎn)基因擬南芥抽薹時葉片數(shù)相對于野生型擬南芥更多。結(jié)果表明MAF2確實具有抑制開花的功能，可以用于晚抽薹的白菜品種的研究。