劉美，馮杉，張娟，陳炫好，張生艷，李先寬*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院，河北 廊坊 065001）

蟾蜍類藥材蟾酥、干蟾、蟾衣來(lái)源于蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺或皮膚腺分泌物、干燥全體及蟾蜍自然脫下的角質(zhì)衣膜[1-3]。前兩種均為國(guó)家藥典或部頒標(biāo)準(zhǔn)收載的藥材，作為抗腫瘤藥物研究和使用的比較多，蟾衣作為一種從民間發(fā)掘的蟾蜍新藥用資源，廣泛用于治療肝癌和消腹水等疾病，且毒性較低。蟾蜍類藥材具有強(qiáng)心、升壓抗休克、抗炎鎮(zhèn)痛、麻醉、抗腫瘤、抗輻射、利尿、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及改善循環(huán)等多種藥理活性[4，5]。用于瘡癀腫毒、咽喉腫痛、化膿性感染、急慢性炎癥、急救昏迷、心力衰竭等癥[6]，是蟾酥丸、麝香保心丸、六神丸等復(fù)方制劑中主要配伍藥材。目前由于蟾蜍類藥材市場(chǎng)需求量不斷增加，吉林、江蘇、山東等省份廣泛分散的蟾蜍養(yǎng)殖沒(méi)有形成統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致蟾蜍類藥材質(zhì)量不均，不同來(lái)源-野生或養(yǎng)殖、不同生長(zhǎng)年限、不同環(huán)境、不同生產(chǎn)加工方法導(dǎo)致藥材質(zhì)量不均一現(xiàn)象嚴(yán)重。本研究以不同產(chǎn)地的蟾蜍類藥材蟾酥、干蟾、蟾衣為研究對(duì)象，對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)年限的蟾蜍類藥材中4種蟾毒配基類成分進(jìn)行測(cè)定，旨在對(duì)不同產(chǎn)地蟾蜍類藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并嘗試性探索干蟾、蟾衣成分積累與生長(zhǎng)年限之間的關(guān)系，為蟾蜍規(guī)范化養(yǎng)殖、藥材質(zhì)量均一化，合理開(kāi)發(fā)、應(yīng)用蟾蜍類藥材資源提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD-20A紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器；Sartorius BT125D電子天平（十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FA2004電子天平（萬(wàn)分之一，上海精天電子儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KDM型調(diào)溫電熱套（北京永興精佳儀器有限公司）；KH3200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

對(duì)照品蟾毒靈、酯蟾毒配基、華蟾酥毒基（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，批號(hào)分別為111981-201501、110718-201108、110803-201406），蟾毒它靈（購(gòu)自天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，批號(hào)20180115）。乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸（分析純），水為重蒸餾水。

1.3 藥材

藥材信息見(jiàn)表1，供試樣品1，2于2017年9月購(gòu)于三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)，樣品3～6于2017年9月吉林省采集，樣品7～12于2017年10月購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，共計(jì)12份樣品，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅(jiān)博士鑒定為蟾酥、干蟾和蟾衣，基原動(dòng)物為中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor。

表1 蟾蜍類藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為迪馬Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%磷酸二氫鉀溶液（B），磷酸調(diào)節(jié)pH為3.2；梯度洗脫，0～15 min，30% ～61%B；15～30 min，61%B；30～32 min，30%B；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm，流速0.7 mL·min－1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL。混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 蟾蜍藥材對(duì)照品及樣品的HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含蟾毒它靈 0.050 3 mg·mL－1、蟾毒靈0.054 3 mg·mL－1、華蟾酥毒基0.084 mg·mL－1、酯蟾毒配基0.050 1 mg·mL－1的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取蟾酥藥材細(xì)粉約25 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

取干蟾藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1小時(shí)，過(guò)濾，濃縮回收甲醇，濃縮液用甲醇準(zhǔn)確定容到5 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

蟾衣藥材細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱回流1小時(shí)，過(guò)濾，濃縮回收甲醇，濃縮液用甲醇準(zhǔn)確定容到5 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取 “2.2.1”4個(gè)對(duì)照品溶液適量，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：蟾毒它靈：Y＝2.290 3X－0.402 6（r＝0.999 9），0.419 2～50.300 0μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系；蟾毒靈：Y＝3.163 5 X－0.109 8（r＝0.999 9），0.010 8～54.300 0μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系；華蟾酥毒基：Y＝2.759 6 X－0.6（r＝0.999 7），0.016 7～84.000 0μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系；酯蟾毒配基：Y＝2.781 5 X－1.050 1（r＝0.999 6），0.009 9～50.100 0μg·mL－1呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精確吸取4種對(duì)照品溶液各20μL，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各對(duì)照品峰面積5次積分值的RSD分別為：蟾毒它靈0.74%；蟾毒靈0.52%；華蟾酥毒基0.83%；酯蟾毒配基0.91%。儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液在 0、3、5、7、9、12 h分別進(jìn)樣20μL，依次測(cè)定，結(jié)果6次測(cè)定峰面積的RSD分別為蟾毒它靈1.51%、蟾毒靈1.74%、華蟾酥毒基0.87%、酯蟾毒配基1.05%。結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，按供試品溶液制備項(xiàng)操作，平行制備6份樣品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算指標(biāo)成分的平均含量為蟾毒它靈10.492 7 mg·g－1，峰面積RSD＝1.67%（n＝6）；蟾毒靈7.370 7 mg·g－1，RSD＝2.76%（n＝6）；華蟾酥毒基 17.734 7 mg·g－1，RSD＝1.70%（n＝6）；酯蟾毒配基 2.08 mg·g－1，RSD＝1.72%（n＝6）。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，每份約25 mg，2份為一組，分別精密加入高、中、低三個(gè)量的蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對(duì)照品貯備液。按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，準(zhǔn)確吸取供試品20μL進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

稱取1.3項(xiàng)下一定質(zhì)量的蟾蜍類藥材，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。每一樣品進(jìn)樣3次，以外標(biāo)法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算蟾蜍藥材樣品各成分含量。所得結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg·g－1，n＝3）

3 討論

近年研究結(jié)果表明，蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基等蟾毒配基類成分在體內(nèi)外對(duì)人肝癌、胃癌、肺癌、腸癌、鼻炎癌、前列腺癌、婦科腫瘤及胰腺癌等多種實(shí)體瘤生長(zhǎng)均有良好的抑制活性[7-9]，其中華蟾酥毒基還具有治療心血管疾病的藥理作用[10]，同時(shí)蟾毒靈對(duì)正常細(xì)胞也具有一定的細(xì)胞毒性[11]。因此，本研究對(duì)蟾蜍類藥材——蟾酥、干蟾皮、蟾衣中這四類成分進(jìn)行了含量測(cè)定。4份市售蟾酥藥材中指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果表明，以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為標(biāo)準(zhǔn)，4份蟾酥藥材樣品華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量0.78%～1.99%，均未能滿足2015年版 《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的總量＞6.0%）[1]。究其原因可能為因其市場(chǎng)價(jià)格較高每千克1萬(wàn)多元，蟾酥在市場(chǎng)流通過(guò)程中，可能被人為摻假。

干蟾是治療腫瘤類疾病的地方藥材，有毒。研究表明，干蟾中的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物具有明顯的抗腫瘤活性。使用過(guò)程中多用于癌癥的治療及配合放、化療，不僅能夠有效抑制癌細(xì)胞的過(guò)度增殖，還具有減輕放、化療毒副作用，改善血象的功效[12-14]。由本實(shí)驗(yàn)指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果可知，吉林與山東干蟾藥材樣品中脂蟾毒配基與華蟾酥毒基含量差別較大，其中山東干蟾（大）樣品，華蟾酥毒基含量最高為0.041 1 mg·g－1，山東干蟾（小）樣品，脂蟾毒配基含量最高為0.017 3 mg·g－1。樣品3與樣品4，樣品9與樣品10含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比表明，干蟾（?。悠分?種指標(biāo)成分——蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量要明顯高于干蟾（大）樣品。

蟾衣作為一種民間藥材研究較少，但其抗肝癌和消腹水作用在民間廣為傳用，且毒性很低。又因?yàn)轶敢率求蛤茏匀幻撓碌慕琴|(zhì)外衣，可人工活體取衣循環(huán)利用，對(duì)蟾蜍不造成任何傷害，是一種很好的可持續(xù)利用中藥新資源。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得蟾衣中華蟾酥毒基平均含量為0.027 0 mg·g－1，脂蟾毒配基平均含量為0.031 3 mg·g－1；樣品5與樣品 6，樣品11與樣品12含量測(cè)定結(jié)果表明，蟾衣樣品中4種指標(biāo)成分含量因蟾蜍生長(zhǎng)年限不同，其藥材質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生差異；脂蟾毒配基含量：蟾衣（大）＜蟾衣（小），蟾毒靈：含量蟾衣（?。俭敢拢ù螅Ｒ虼?，蟾衣作為微毒類藥材，其用量可根據(jù)蟾蜍生長(zhǎng)年限（或同基原蟾蜍蟾衣大?。┑牟煌M(jìn)行合理調(diào)整。