王紅梅，葛秉宜，王穎，劉晶，朱夢云，張立平

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京市懷柔區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 101400；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）包括腹型肥胖、胰島素抵抗或糖耐量異常、高血壓、血脂異常4個疾病組分[1]，越來越多的研究認(rèn)為MetS關(guān)鍵發(fā)病因素為胰島素抵抗，其最終可導(dǎo)致心肌梗死、中風(fēng)等心腦血管惡性事件的發(fā)生，故MetS又被稱為胰島素抵抗綜合征和代謝性心腦血管綜合征[2]。一些研究[3-7]認(rèn)為MetS的慢性炎癥狀態(tài)是MetS最終發(fā)展為動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)，其中細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）在動脈粥樣硬化形成過程中起著重要的作用[8]，MetS病人的ICAM-1和VCAM-1水平明顯增高[9]，因此黏附因子也成為評價MetS療效的有用工具[10]。

本課題組既往工作證實(shí)具有健脾疏肝、活血化瘀功效的柴芪湯（由黃芪、柴胡、白術(shù)、枳實(shí)及三七粉組成）干預(yù)MetS有效，對相關(guān)炎性因子具有調(diào)節(jié)作用[11-15]。本研究使用喂養(yǎng)型MetS大鼠模型觀察柴芪湯對ICAM-1和VCAM-1的動態(tài)影響，進(jìn)一步研究柴芪湯防治MetS療效及可能的抗炎作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量（280±10）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司 [實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京2012-0001）]。

1.2 藥物和試劑

自擬方柴芪湯由黃芪30g、柴胡10 g、白術(shù)10 g、枳實(shí)10 g及三七粉3 g 5味中藥組成，上述飲片購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房，并由該院煎藥室代煎制備，煎制過程嚴(yán)格遵照國家中醫(yī)藥管理局制定的 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國中醫(yī)藥發(fā) 〔2009〕3號）執(zhí)行。

普通清潔級動物飼料及高脂高糖高鹽配制飼料（含大鼠基礎(chǔ)飼料52.5%、其余由熟豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇2%、奶粉10%、果糖10%、食用鹽5%、膽鹽0.5%組成）均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

生化試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司，放射免疫分析試劑盒購自北京福瑞潤康生物技術(shù)有限公司，酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組

60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，染發(fā)劑標(biāo)號，分別為正常組18只，模型組24只，中藥預(yù)防組18只。在第8周末取材后，從模型組中隨機(jī)抽取6只作為中藥治療組，此時共4組大鼠，每組6只（筆者前期實(shí)驗(yàn)研究[11-15]已經(jīng)比較了柴芪湯與羅格列酮組對MetS的療效。而本研究重點(diǎn)探討柴芪湯預(yù)防性給藥和治療性給藥的療效差異，故未設(shè)陽性對照藥組）。以上大鼠采取分籠飼養(yǎng)，每籠6只，動物室室內(nèi)溫度19～24℃，相對濕度60%～70%，自由飲水，明暗周期12 h／12 h，各組大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始模型制備。

2.2 造模

正常組：僅給基礎(chǔ)飼料12周。模型組：給予高脂高糖高鹽飼料12周。中藥預(yù)防組：自造模第1周開始給予高脂高糖高鹽飼料12周，從第1周給予柴芪湯 5.71 g·kg－1·d－1灌胃（本研究重點(diǎn)不是探討柴芪湯的量效關(guān)系，而且本課題組前期研究[11]已經(jīng)就柴芪湯高中低劑量對MetS的治療效果進(jìn)行了探討。本研究依照 “人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”計算柴芪湯的等效劑量，該計算方法為大家公認(rèn)，且與本課題組上述研究結(jié)果一致）。中藥治療組：自造模第1周開始給予高脂高糖高鹽飼料12周，從第 9周給予柴芪湯 5.71 g·kg－1·d－1灌胃。每天給予正常組和模型組等同中藥組所灌服中藥體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

2.3 取材

于第4、8、12周的周末進(jìn)行取材，每組隨機(jī)抽取6只。

大鼠血清的獲?。喝⊙敖?2 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.7 mL·kg－1），真空采血管腹主動脈取血，靜置0.5 h后置于離心機(jī)中以4℃、3000 r·min－1離心15 min，移液槍吸取血清，放置－80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 指標(biāo)測定

全自動生化分析儀檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）。放免法檢測空腹胰島素（FINS）。ELISA法測定血清 ICAM-1、VCAM-1。上述具體操作按照試劑盒說明書。根據(jù)FBG和FINS，按照HOMA穩(wěn)態(tài)模型，計算出胰島素抵抗指數(shù)（IRI）＝（FBG×FINS／22.5），評價胰島素抵抗情況。

2.5 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清FGB、FINS、IRI和血脂比較

第8周模型組與正常組相比，模型組FBG增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；FINS值增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；IRI值較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

第12周中藥治療組與模型組相比，治療組FBG、FINS、IRI均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中藥預(yù)防組與模型組相比，預(yù)防組 FBG、FINS、IRI均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中藥預(yù)防組與治療組相比，預(yù)防組FBG和FINS均較低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），預(yù)防組IRI值較治療組低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

第8周模型組與正常組相比，模型組TC及LDL升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組TG較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組HDL較正常組略低，但兩組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第12周中藥治療組與模型組相比，治療組TC、TG、LDL均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而兩組間HDL無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。中藥預(yù)防組與模型組相比，預(yù)防組TC、TG、LDL均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而兩組間HDL無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。中藥預(yù)防組與治療組相比，預(yù)防組TC較低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；LDL也降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；而兩組間TG及HDL無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表1 柴芪湯各組大鼠血清FGB、FINS和IRI變化（±s，n＝6）

表1 柴芪湯各組大鼠血清FGB、FINS和IRI變化（±s，n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥預(yù)防組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；下同。

IRI第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常組 7.12±1.39 8.26±0.67 6.57±1.38 6.60±0.71 2.04±0.44 2.41±0.24模型組 9.47±2.25* 10.55±1.55** 7.64±1.39 8.37±1.24* 3.14±0.48** 3.93±0.81**中藥預(yù)防組 6.88±1.31△ 4.77±0.63**△△ 7.75±0.92 4.89±1.10*△△ 2.39±0.58△ 1.04±0.27**△△中藥治療組 6.11±0.69**△△＃ 6.15±1.37△△ 1.67±0.42*△△＃FBG／mmol·L－1 FINS／mIU·L－1組別

表2 柴芪湯各組大鼠TC、TG、HDL、LDL變化±s，n＝6）mmol·L－1

表2 柴芪湯各組大鼠TC、TG、HDL、LDL變化±s，n＝6）mmol·L－1

TC TG HDL LDL第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常組 1.56±0.28 1.91±0.25 0.24±0.07 0.34±0.07 1.13±0.22 1.11±0.29 0.22±0.04 0.42±0.05模型組 2.30±0.30**2.37±0.22** 0.32±0.07* 0.45±0.08* 1.02±0.19 1.08±0.11 0.55±0.20**0.53±0.06**中藥預(yù)防組 1.82±0.35△ 1.25±0.15**△△ 0.20±0.05△△ 0.20±0.02**△△ 0.92±0.22 1.25±0.26 0.39±0.10*△ 0.24±0.04**△△中藥治療組 1.55±0.23*△△＃ 0.27±0.07△△ 1.13±0.11 0.33±0.07*△△＃＃

3.2 各組大鼠血清ICAM-1濃度比較

第4周的模型組ICAM-1濃度較正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組與模型組之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第8周的模型組ICAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥預(yù)防組的ICAM-1濃度低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

第12周的模型組ICAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥治療組和中藥預(yù)防組較正常組均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥治療組低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥預(yù)防組低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組低于治療組，兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

3.3 各組大鼠血清VCAM-1濃度比較

第4周的模型組VCAM-1濃度較正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組相比正常組升高，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥預(yù)防組低于模型組，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第8周的模型組VCAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組相比正常組升高，差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥預(yù)防組低于模型組，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

第12周的模型組VCAM-1濃度相比正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥治療組較正常組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組較正常組升高，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥治療組低于模型組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥預(yù)防組低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥預(yù)防組相比治療組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

4 討論

目前MetS動物模型大多采用誘發(fā)性模型。根據(jù)誘發(fā)物質(zhì)的不同分為食物誘發(fā)性模型、化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)性模型、喂養(yǎng)＋化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)性模型和外科手術(shù)干預(yù)模型等。相比其他幾種造模方法，食物誘發(fā)性模型的好處在于可模擬環(huán)境因素如限制其活動等，成模率較高，模型接近臨床，但造模時間較長，模型相對不穩(wěn)定。本研究采用高脂高糖高鹽飲食8周誘導(dǎo)造模方法已經(jīng)被我們課題組之前的研究[11-15]多次使用并驗(yàn)證。造模和成模情況與其他課題組研究結(jié)果[16-18]一致。本實(shí)驗(yàn)中大鼠經(jīng)高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)8周后，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠IRI升高（P＜0.01），血脂 TC（P＜0.01）、TG（P＜0.05）、LDL（P＜0.01）升高，出現(xiàn)典型MetS組分，提示造模成功。第12周的中藥治療組、預(yù)防組與模型組相比，IRI、TC、TG、LDL均較模型組降低（P＜0.01）。中藥預(yù)防組與治療組相比，IRI、TC值均比治療組低（P＜0.05），LDL也降低（P＜0.01）；再次證實(shí)了柴芪湯對于MetS糖脂代謝和胰島素抵抗的調(diào)節(jié)作用。

表3 柴芪湯各組大鼠血清ICAM-1濃度（±s，n＝6）ng·L－1

表3 柴芪湯各組大鼠血清ICAM-1濃度（±s，n＝6）ng·L－1

時間 正常組 模型組 中藥預(yù)防組 中藥治療組第4周 42.29±3.75 57.76±5.31** 53.72±4.16**第8周 41.53±4.14 64.06±9.14** 52.67±11.81*△第12周 42.93±2.26 69.33±11.45** 54.47±9.18*△△ 65.63±6.48*＃

表4 柴芪湯各組大鼠血清VCAM-1濃度（±s，n＝6）μg·L－1

表4 柴芪湯各組大鼠血清VCAM-1濃度（±s，n＝6）μg·L－1

時間 正常組 模型組 中藥預(yù)防組 中藥治療組第4周 472.81±70.2 648.02±110.90** 563.22±61.01第8周 532.25±60.11 701.00±111.93** 620.47±123.67第12周 541.44±87.43 710.98±82.00** 575.87±29.32△△ 679.88±57.41**＃

ICAM-1和VCAM-1同屬免疫球蛋白家族。生理情況下ICAM-1不表達(dá)或呈低表達(dá)或狀態(tài)，當(dāng)有炎癥反應(yīng)發(fā)生，ICAM-1可在外界刺激下表達(dá)增強(qiáng)。VCAM-1出現(xiàn)晚于前者，可表達(dá)于經(jīng)外界刺激而活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面，兩種黏附分子均參與炎癥反應(yīng)。而血清ICAM-1和VCAM-1的濃度水平可以反應(yīng)動脈內(nèi)皮 ICAM-1和 VCAM-1的表達(dá)水平[19-20]。Davies等[21]研究表明，在動脈粥樣硬化發(fā)生過程的不同時期，內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)量也不同，其中ICAM-1、VCAM-1在脂紋期主要表達(dá)于動脈內(nèi)皮細(xì)胞表面，可促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)入炎癥部位；而隨著病變的進(jìn)展，黏附分子在內(nèi)皮的表達(dá)逐漸減弱，而在纖維斑塊中其表達(dá)增強(qiáng)，提示 ICAM-1、VCAM-1是動脈粥樣硬化早期的病理變化及斑塊進(jìn)展的潛在機(jī)制，并與硬化嚴(yán)重程度有關(guān)。多個研究[22-25]亦證實(shí)MetS患者的可溶性ICAM-1和VCAM-1水平明顯增高，其與MetS患者的動脈內(nèi)皮損失、動脈粥樣硬化密切相關(guān)。本研究中模型組血清ICAM-1和VCAM-1比正常組的高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)了MetS的炎性機(jī)制。

關(guān)于柴芪湯對黏附分子的影響作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4周末的模型組大鼠 ICAM-1已經(jīng)開始升高，而中藥預(yù)防組的升高程度相比模型組較低，但差異不具統(tǒng)計學(xué)意義，而8周末及12周末的中藥預(yù)防組ICAM-1濃度的升高低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明柴芪湯對炎癥因子具有抑制作用，但中藥預(yù)防組的濃度相比正常組升高，而且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明單純的中藥預(yù)防可能無法完全祛除病因（高脂高鹽高糖飲食）；于第9周開始進(jìn)行中藥治療的中藥治療組大鼠在第12周末的ICAM-1濃度的升高相比模型組較低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并且相比中藥預(yù)防組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是MetS模型大鼠8周的造模使得血管內(nèi)皮功能受損害程度較初期更為嚴(yán)重，后期的干預(yù)無法達(dá)到和前期預(yù)防相同的水平。3個時間點(diǎn)的模型組大鼠VCAM-1水平均較正常組升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，第4周末和第8周末的中藥預(yù)防組的VCAM-1濃度的升高雖低于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第12周末的中藥預(yù)防組的VCAM-1水平則明顯低于模型組（P＜0.01），考慮可能為本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定的中藥湯劑給藥濃度[26]不足以在前期（8周內(nèi)）對VCAM-1的表達(dá)產(chǎn)生明顯抑制。在第12周末的中藥治療組出現(xiàn)了和ICAM-1水平相似的結(jié)果，筆者認(rèn)為前期預(yù)防效果良好正是體現(xiàn)了中醫(yī)對MetS多種代謝異常聚集的疾病進(jìn)行未病先治優(yōu)勢所在，其通過調(diào)理脾胃運(yùn)化功能以改善血管功能，延緩重要臟器血管疾病的發(fā)生。

代謝綜合征的中醫(yī)病名討論及對癥、辨證治療的相關(guān)研究仍處于以個人臨床經(jīng)驗(yàn)為主導(dǎo)的局面。本課題組認(rèn)為脾失健運(yùn)、肝失疏泄是代謝綜合征的核心病機(jī)，肝氣不舒、脾不散精、物不歸正則化為痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物，積聚于重要臟器，可進(jìn)一步發(fā)展為心腦血管疾?。贿@與MetS的整個病程發(fā)展密切相關(guān)。臨床上我們以疏肝健脾之柴芪湯對MetS患者進(jìn)行干預(yù)，取得良好的療效。其中柴胡具有疏肝解郁的功效，是治療肝氣不舒的代表藥物，多種研究證實(shí)其具有抗炎作用[27]、其有效成分柴胡皂苷能抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥形成[28]。黃芪為補(bǔ)脾升陽的要藥，其補(bǔ)氣之力強(qiáng)，兼能通調(diào)水道，利濕驅(qū)邪。現(xiàn)代藥理研究顯示黃芪具有降糖作用[29]，還可顯著降低高血壓患者的炎癥遞質(zhì)水平，有效防治和緩解動脈粥樣硬化癥狀[30]。關(guān)于白術(shù)的功用，研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)的主要成分為蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯及糖類，除了有利尿、抗炎的功效，還能減肥和降血糖[31]，與黃芪相配伍，可分別補(bǔ)益胸中及脾胃之氣。枳實(shí)善破氣除痞，化痰消積，其藥理作用也包括調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動、降低膽固醇等，對高脂血癥患者的血脂及內(nèi)皮功能有改善作用[32]。三七為活血化瘀止血的要藥，研究表明三七中的活性成分可通過抑制NF-κB和MAPK通路從而起到抗炎的作用[33]。三七中的活血成分三七總皂苷可促進(jìn)纖維酶活性、抑制血小板聚集，并降低全血黏度，達(dá)到顯著抗凝的效果[34-35]。綜上，整個組方的特點(diǎn)為補(bǔ)氣理氣為主、疏肝健脾并重，兼以活血化瘀、祛濕燥痰，從整體對代謝綜合征尤其是證屬肝郁脾虛的進(jìn)行綜合調(diào)理。

關(guān)于柴芪湯給藥時機(jī)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，自第9周起給藥的中藥治療組的黏附因子表達(dá)雖低于模型組但并不明顯，而自第1周開始給藥的預(yù)防組則顯現(xiàn)出升高程度明顯低于模型組的結(jié)果。筆者認(rèn)為正是由于ICAM-1和VCAM-1在動脈粥樣硬化的初期主要表達(dá)在動脈內(nèi)皮細(xì)胞表面，所以前期給藥預(yù)防的效果明顯優(yōu)于后期干預(yù)，由此提示在臨床上對于心腦血管疾病高危人群，應(yīng)予以高度警惕并根據(jù)中醫(yī)辨證進(jìn)行適時干預(yù)，以延緩或減輕血管內(nèi)皮病理改變從而達(dá)到防治MetS并降低心腦血管疾病風(fēng)險的目的。