邱久文，李志強(qiáng)，王紅穎，房宗寶，吳海波，林天澤，李美松

（1.通化玉圣藥業(yè)有限公司，吉林 通化 134008；2.浙江大遠(yuǎn)智慧制藥工程技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000）

大株紅景天注射液為大株紅景天Rhodiola kirilowii（Regel）Regel.干燥根及根莖經(jīng)水提醇沉制備而成的中藥注射劑，于2006年批準(zhǔn)上市，是選用紅景天單味藥研制的治療冠心病、心絞痛的臨床急癥注射用藥，臨床上還被廣泛用于腦卒中、心衰、心肌梗死以及肺病、肝臟疾病的治療。經(jīng)研究表明大株紅景天注射液的主要化學(xué)成分有紅景天苷、酪醇及其苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸及其苷類(lèi)等[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，紅景天提取物具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗氧化、鎮(zhèn)痛、對(duì)中樞神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)雙向調(diào)節(jié)等多種藥理活性。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷在實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血損傷方面具有保護(hù)作用，其抗心肌缺血損傷的作用機(jī)制主要是通過(guò)清除氧自由基、抗氧化抗凋亡、提高O型乙酰葡萄胺蛋白質(zhì)水平以及促進(jìn)缺血區(qū)血管新生減小梗死面積等途徑[3-7]。為了驗(yàn)證大株紅景天注射液在治療冠心病心絞痛方面的作用，本文采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法造成大鼠急性心肌缺血模型，觀察大株紅景天注射液的抗心肌缺血作用。

1 材料

1.1 受試藥物

大株紅景天注射液（通化玉圣藥業(yè)有限公司），規(guī)格：5 mL／支，批號(hào)：3／1001150608。

1.2 儀器與試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司），INFINITE M1000全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，MP150生理記錄儀（美國(guó)BIOPAC公司），CTNI測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：201605），CK測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：201606），LDH測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：201606），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，南京建成生物工程研究所，規(guī)格：每瓶5 g，批號(hào)：201605）。以pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制成所需的溶液供染色用。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠40只，SPF級(jí)，雄性，220～260 g，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證：SCXK（浙）2014-0001。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組（Sham Operation Group，SO）、模型對(duì)照組（Model Group，MG）、紅景天低劑量組（HJTL）、紅景天高劑量組（HJTH），每組10只。低劑量組和高劑量組分別每天尾靜脈注射紅景天原液2、4 mL·kg－1，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

2.2 模型制備

將大鼠戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉，仰臥位固定。二導(dǎo)聯(lián)心電圖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。沿左側(cè)第4、5肋間剪開(kāi)左胸部皮膚，少量鈍性分離胸肌，止血鉗撐開(kāi)胸廓，暴露心臟，將心臟輕輕擠出胸壁外，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間，距左冠狀動(dòng)脈前降支起始部3 mm處穿線（用帶有4-0縫合線的3／8彎針鉤），結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，隨后將心臟送回胸腔，擠出胸腔內(nèi)空氣，閉合胸腔縫合傷口并接呼吸機(jī)，恢復(fù)自主呼吸。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)過(guò)程與上述相同，只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

2.3 心肌梗死范圍測(cè)定及組織學(xué)檢測(cè)

模型大鼠連續(xù)給藥7 d后，迅速摘離心臟，0.9%氯化鈉溶液中清洗，除去血管等異物，每組取7只將心臟均勻切成5片，并置于1%TTC溶液中，37℃加熱5 min，非梗死區(qū)呈鮮紅色，梗死區(qū)呈灰白色。顯微鏡拍照，用圖像處理軟件Image Pro Plus統(tǒng)計(jì)梗死面積占心臟切片總面積的比重。每組取3只心臟進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，心臟組織固定于10%福爾馬林中，后用石蠟包埋。石蠟包埋的心臟組織制成石蠟切片后用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）進(jìn)行染色，以及進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，于400X光學(xué)顯微鏡下觀察采集圖像。

2.4 心肌酶和心肌肌鈣蛋白的測(cè)定

大鼠末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg·kg－1麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3.2%枸櫞酸鈉抗凝，全血與抗凝劑體積之比9∶13，500 r·min－1離心10 min分離血漿，置于冰箱（－20℃）保存?zhèn)溆?。按試劑盒方法測(cè)定血漿肌酸激酶（CK）、心肌肌鈣蛋白（CTNI）、乳酸脫氫酶（LDH）活性，每組檢測(cè)7份血樣。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積的變化

冠狀結(jié)扎前后大鼠心電圖改變?nèi)鐖D1所示。大鼠左心室薄片經(jīng)TTC染色觀察梗死發(fā)生的狀況，在體視顯微鏡下觀察表明，對(duì)照組梗死區(qū)域極小，模型組梗死區(qū)域較大，紅景天低、高劑量組給藥后心肌缺血梗死區(qū)域小于模型組。對(duì)梗死區(qū)域（白色部分）面積用Image Pro Plus軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算梗死區(qū)面積與整個(gè)心肌薄片面積的比值。結(jié)果表明，與模型組比較，低劑量和高劑量組的心肌梗死面積數(shù)值顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖 2、圖3。

圖1 冠脈結(jié)扎前后大鼠心電圖改變

圖2 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)大鼠急性心肌梗死面積區(qū)域影響 （n＝7）

3.2 心臟組織HE和免疫組化染色后的觀察結(jié)果

大鼠左心室切片經(jīng)HE染色觀察組織形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀察表明，假手術(shù)組正常心肌細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)染色均勻，核成圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，模型組梗死區(qū)域出現(xiàn)大片無(wú)核區(qū)域。黏附分子CD11b免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示模型組梗死區(qū)域中性粒細(xì)胞表面CD11b表達(dá)明顯增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重。紅景天低、高劑量組給藥后可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。結(jié)果表明，與模型組比較，低劑量和高劑量組可抑制急性心肌缺血大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減少心肌梗死面積，如圖4、圖5所示。

圖3 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)大鼠急性心肌梗死面積比率的影響（n＝7）

3.3 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血漿，測(cè)定大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI水平。結(jié)果可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組的心肌肌鈣蛋白數(shù)值明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量組的血漿肌鈣蛋白水平降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），高劑量組的血漿肌鈣蛋白水平顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.4 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)大鼠血漿肌酸激酶CK的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血漿，測(cè)定各組大鼠血漿肌酸激酶CK。結(jié)果可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組的肌酸激酶CK明顯升高（P＝0.313 0）；與模型組比較，大株紅景天低、高劑量組的心肌酶水平有降低趨勢(shì)（P＝0.549 7，P＝0.094 4），并呈現(xiàn)出量效相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)圖7。

3.5 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血漿，測(cè)定各組大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH。結(jié)果可見(jiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組的乳酸脫氫酶LDH數(shù)值明顯升高（P＝0.056 1）；與模型組比較，大株紅景天低、高劑量組的乳酸脫氫酶水平呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)（P＝0.439 7，P＝0.330 5），結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖4 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠左心室橫截面HE及CD11b染色情況的影響（n＝3）

圖5 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠左心室組織中炎性細(xì)胞聚集作用比較（n＝3）

圖6 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠血漿心肌肌鈣蛋白CTNI的影響（n＝7）

圖7 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠血漿肌酸激酶CK的影響（n＝7）

圖8 不同濃度大株紅景天注射液對(duì)心肌缺血大鼠血漿乳酸脫氫酶LDH的影響（n＝7）

4 討論

大鼠心肌缺血造模方法很多，經(jīng)典的造模方法為結(jié)扎大鼠心肌冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌缺血模型。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法能人為模擬臨床心肌梗死過(guò)程中冠狀動(dòng)脈梗死，其梗死部位、分布范圍相對(duì)一致，病理生理、生化改變與臨床心肌梗死相似[8]。本實(shí)驗(yàn)采用手術(shù)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支方法制做急性心肌缺血模型。結(jié)果顯示，與模型組比較，低劑量和高劑量組的心肌梗死面積數(shù)值明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明大株紅景天注射液在低劑量和高劑量組能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面積。大鼠左心室切片經(jīng)HE染色觀察組織形態(tài)，觀察到模型組梗死區(qū)域出現(xiàn)大片無(wú)核區(qū)域，而大株紅景天注射液干預(yù)后可改善這一現(xiàn)象，進(jìn)一步確證了大株紅景天注射液能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面積。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，低劑量和高劑量的心肌梗死區(qū)域中性粒細(xì)胞表面黏附分子CD11b表達(dá)明顯降低，顯著改善炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水平，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），說(shuō)明紅景天注射液在低劑量和高劑量能夠有效抑制心肌梗死大鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

CTNI在預(yù)測(cè)MIS、評(píng)估溶栓效果、鑒別不穩(wěn)定性心絞痛等多個(gè)領(lǐng)域有重要價(jià)值，常被作為診斷心肌損傷的標(biāo)志物，具有高靈敏度、高特異性、出現(xiàn)早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)[9-10]。心肌缺血損傷時(shí)，由于自由基堆積和Ca2＋超載，損傷了細(xì)胞膜和線粒體，CTNI可通過(guò)破損的細(xì)胞膜彌散進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，隨之進(jìn)入血管和淋巴管內(nèi)引起血漿中 CTNI的增加[11]，因此觀察藥物對(duì)心肌CTNI的影響，是判斷其是否具有抗心肌缺血損傷作用的一個(gè)主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，低劑量組的血漿肌鈣蛋白水平低于模型組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），高劑量組的血漿肌鈣蛋白水平顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），說(shuō)明大株紅景天注射液在高劑量組濃度下能夠有效減輕心肌缺血大鼠心肌損傷。

LDH是一種糖酵解酶，是體內(nèi)能量代謝過(guò)程中的一種重要的酶，此酶幾乎存在于所有的組織中，當(dāng)少量組織壞死時(shí)此酶即釋放入血，使其在血液中的活力升高[12]。CK通常存在于心臟、肌肉、腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，肌酸激酶在臨床診斷中有重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗死發(fā)生時(shí)血漿中的肌酸激酶水平迅速升高[13]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，大株紅景天注射液低、高劑量組均能一定程度地降低CK和LDH水平，其中大株紅景天高劑量組CK和LDH下降趨勢(shì)較大株紅景天低劑量組更為明顯，可見(jiàn)大株紅景天對(duì)心肌梗死大鼠血清LDH、CK的影響有一定的量效關(guān)系。

綜上所述，大株紅景天注射液在高劑量時(shí)能夠有效減少急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面積，顯著改善心肌梗死區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，顯著降低血漿心肌肌鈣蛋白CTNI的水平，并能降低血漿心肌酶CK和LDH的活力，高劑量濃度（4 mL·kg－1）對(duì)急性心肌缺血大鼠有良好的保護(hù)作用。