鄭楚珊 詹嘉紅

摘 要：過(guò)氧化物酶（POD）是參與酚類物質(zhì)氧化，并且在果蔬酶促褐變中發(fā)揮著重要作用的主要酶類之一。該研究以臺(tái)灣青棗果實(shí)為材料，以愈創(chuàng)木酚為底物，采用分光光度法對(duì)該果實(shí)POD部分酶學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，臺(tái)灣青棗果實(shí)POD的最適pH值為5.8，最適溫度為40℃。pH值小于3.0時(shí)酶基本失活，溫度高于70℃時(shí)也基本失活。該酶熱穩(wěn)定性較差，100℃處理超過(guò)15s時(shí)，酶幾乎鈍化。抗壞血酸和NaHSO對(duì)POD有明顯的抑制作用，而EDTA的抑制作用較弱。3種化合物的抑制效果依次是抗壞血酸>NaHSO3>EDTA。

關(guān)鍵詞：臺(tái)灣青棗；過(guò)氧化物酶；酶學(xué)特性

中圖分類號(hào) Q554 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）14-0025-04

Partial Characteristic of Peroxidase in Indian Jujube Fruits

Zheng Chushan1 et al.

（1Shantou No. 4 Middle School，Shantou 515041 China）

Abstract：Peroxidase（POD） is one of the major oxidases involving in the oxidation of phenolics and plays important roles in enzymatic browning of fruits and vegetables. With spectrophotometry method and based on substrate of guaiacol，the enzymatic characteristics of peroxidase（POD） from Indian jujube fruits were studied. Results showed that the optimum pH and temperature of POD were 5.8 and 40℃. At the pH value of less than 3.0 and the temperature higher than 70℃ were basically undetectable activity. The POD had poor thermal stability，its activity was completely passivated when it was incubated at 100℃ and dealing with more than 15s. Ascorbic acid and NaHSO3 had great inhabitation effect on POD，and EDTA was weaker. Their inhibitory capacity was decreased in the order：ascorbic acid>NaHSO3 >EDTA.

Key words：Indian jujube（Ziziphus mauritiana Lamk.）；Peroxidase；Enzymatic characteristic

臺(tái)灣青棗（Ziziphus mauritiana Lamk.），又稱毛葉棗、印度棗、滇刺棗、西西果等，屬鼠李科棗屬植物[1]。臺(tái)灣青棗是我國(guó)從臺(tái)灣引進(jìn)的熱帶亞熱帶特色水果，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維及大量黃酮類化合物，尤其是VC含量，每100g臺(tái)灣青棗果肉VC是蘋果的56倍[2]，比號(hào)稱“VC之王”的中華獼猴桃（47～255mg/100g）含量還高[3，4]，因而，有“熱帶小蘋果”、“天然維生素丸”的美稱。臺(tái)灣青棗以其果大，核細(xì)，甜度適中，口味獨(dú)特，并具有較高的藥用價(jià)值和保健作用，如健脾強(qiáng)身、清涼解毒、鎮(zhèn)靜安神等功效[5]，越來(lái)越受到消費(fèi)者的喜愛。但臺(tái)灣青棗果實(shí)較不耐貯藏，鮮果在常溫下極易失水皺縮、變黃、變褐和腐爛，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值和食用品質(zhì)[6]，其中，酶促褐變是臺(tái)灣青棗品質(zhì)下降的一個(gè)重要原因。

過(guò)氧化物酶（peroxidase，簡(jiǎn)稱POD）是果蔬中普遍存在的一類氧化還原酶，是果蔬成熟和衰老的生理指標(biāo)[7]，研究表明過(guò)氧化物酶參與了果蔬的酶促褐變[8-10]。近年來(lái)對(duì)臺(tái)灣青棗果實(shí)采后保鮮研究多集中在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[11，12]、涂膜[13]和CaCl2[14]處理等方面，而對(duì)其與褐變關(guān)系密切相關(guān)的過(guò)氧化物酶特性研究則鮮見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)擬以臺(tái)灣青棗果實(shí)為原料，對(duì)其過(guò)氧化物酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為了解臺(tái)灣青棗果實(shí)采后褐變?cè)蚣爸贫ǚ篮执胧┨峁├碚撘罁?jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料為無(wú)損傷、無(wú)病蟲害、成熟度為70%～80%成的臺(tái)灣青棗蜜棗品種，購(gòu)自當(dāng)?shù)毓麍?chǎng)。

1.2 試劑及儀器 愈創(chuàng)木酚、30%過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、抗壞血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、亞硫酸氫鈉等，以上試劑均為分析純。UV2100型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；PHS-2C型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）等。

1.3 方法

1.3.1 POD的提取 稱取臺(tái)灣青棗果肉5g，加入10mL預(yù)冷0.05mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液，低溫研磨至勻漿，并定容至25ml后，低溫離心（10000r/min，20min），上清液即為酶的粗提液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 POD活性測(cè)定[15] 采用愈創(chuàng)木酚法，反應(yīng)體系：0.05mol/L pH6.0磷酸緩沖液2.5mL+0.05mol/L愈創(chuàng)木酚1.5mL+1% H2O2 0.5mL+0.5mL酶液。于室溫下測(cè)定波長(zhǎng)470nm的OD值，對(duì)照以緩沖液代替酶液，結(jié)果以POD的相對(duì)酶活（%）表示。

1.3.3 POD最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 按1.3.2的測(cè)定方法，總反應(yīng)體系分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5min，測(cè)其OD值。

1.3.4 POD最適pH的測(cè)定 用不同pH（范圍2.2～8.0）磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液取代反應(yīng)體系中的磷酸鹽緩沖液，按1.3.2的測(cè)定方法，在室溫下測(cè)定不同pH值下的OD值。

1.3.5 POD最適溫度的測(cè)定 按1.3.2測(cè)定方法取樣，在先不加酶液的情況下，最適pH緩沖液和反應(yīng)底物分別在不同溫度（10～70℃）條件下保溫15min后，加入酶液繼續(xù)在原溫度下保溫1min，于室溫下測(cè)定不同溫度條件下的OD值。

1.3.6 POD熱穩(wěn)定性的測(cè)定 取等量酶液若干份，置100℃水浴中加熱處理，按一定時(shí)間間隔取出后，迅速冷卻，按1.3.2的測(cè)定方法，于室溫下測(cè)定不同熱處理時(shí)間的OD值。

1.3.7 化合物對(duì)POD活性影響的測(cè)定 按1.3.2測(cè)定方法取樣，向反應(yīng)體系分別加入一定濃度的化合物，使化合物的最終濃度分別是：NaHSO3為0、5、10、15、20、25g/L；抗壞血酸為0、25、50、75、100、125mg/L；EDTA–2Na為0、3、6、9、12、15、18g/L，在最適溫度、最適pH下測(cè)定不同濃度化合物的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD的最佳反應(yīng)時(shí)間 由圖1可知，在酶促反應(yīng)進(jìn)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率會(huì)逐漸降低，因隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物濃度會(huì)減少、產(chǎn)物濃度會(huì)增加、酶活性會(huì)下降。因此為消除干擾因素，酶促反應(yīng)速率是以初速率表示[16]。由圖可知，在反應(yīng)初期的前2min內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，OD值幾乎成直線上升，即在這一時(shí)間段，酶促反應(yīng)速率基本保持不變。因此本實(shí)驗(yàn)確定的酶促反應(yīng)時(shí)間以不超過(guò)2min為宜。

2.2 pH對(duì)POD活性的影響 環(huán)境pH值是影響酶活性的重要因素之一，每種酶只能在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，而在這個(gè)范圍內(nèi)，酶活性常隨著環(huán)境pH的改變而改變。由圖2可知，該酶的最適pH值為5.8，pH值在5.0～7.4，酶均表現(xiàn)出較高活性，相對(duì)活性在80%以上。由于過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境會(huì)使酶變性失活，當(dāng)pH值從5.8降至4.2或升至8.0時(shí)，酶活性均迅速下降，相對(duì)殘留活性降至46%，當(dāng)pH低于3.0時(shí)，酶接近失活。因此，在臺(tái)灣青棗的貯運(yùn)保鮮或加工過(guò)程中，適當(dāng)降低pH值可作為抑制褐變發(fā)生的有效措施，如通過(guò)添加食用酸等方法可一定程度抑制該酶的活性。

2.3 溫度對(duì)POD活性的影響 溫度對(duì)酶活性的影響具有雙重性。在較低溫度范圍內(nèi)，酶活性隨著溫度的升高而升高，但當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度后，隨著溫度的升高酶活性反而降低。溫度對(duì)臺(tái)灣青棗POD活性的影響如圖3。由圖3可知，該酶的最適溫度為40℃，在25～50℃范圍，該酶保持著較高活性，相對(duì)活性均在75%以上，而當(dāng)溫度為10℃時(shí)，POD相對(duì)活性僅有24.4%，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活性迅速下降，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，酶基本失活。因此，對(duì)臺(tái)灣青棗的保鮮防褐，鮮果可采用低溫冷藏的方法來(lái)進(jìn)行，而對(duì)加工食品則可通過(guò)適當(dāng)?shù)臒崽幚韥?lái)達(dá)到。

2.4 POD的熱穩(wěn)定性 由圖4可知，在處理的前7s內(nèi)，酶殘留活性仍保持在80%以上，當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)7s后，酶活性迅速下降，處理時(shí)間達(dá)到13s時(shí)，殘留活性不到20%，當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)15s時(shí)，酶活性幾乎鈍化。因此，臺(tái)灣青棗的加工產(chǎn)品可通過(guò)瞬間高溫處理來(lái)達(dá)到抑制褐變的目的。

2.5 化合物對(duì)POD活性的影響 由圖5、圖6和圖7可知，3種化合物及其濃度對(duì)臺(tái)灣青棗POD活性均有不同程度的抑制作用。當(dāng)NaHSO3濃度在0～15g/L，隨著濃度的增加，POD活性逐漸下降，當(dāng)濃度超過(guò)15g/L時(shí)，酶活性降低更加明顯，當(dāng)濃度為25g/L時(shí)，酶活性受抑制程度達(dá)到94.6%?？箟难釢舛仍?～50mg/L，隨著濃度的增加，POD活性迅速下降，當(dāng)抗壞血酸濃度為75mg/L時(shí)，殘留活性僅為15%，當(dāng)濃度升至125mg/L時(shí)，POD活性幾乎被完全抑制。相比上面2種抑制劑，EDTA對(duì)POD活性抑制程度較低，當(dāng)EDTA濃度在0～6.0g/L，隨著濃度的增加，酶活性逐漸降低，但當(dāng)EDTA濃度達(dá)到6.0g/L及以上時(shí)，酶活性基本趨于穩(wěn)定，并一直保持在相對(duì)酶活60%左右。

根據(jù)上面試驗(yàn)結(jié)果，以較低抑制劑濃度呈現(xiàn)出最佳抑制效應(yīng)分析，抗壞血酸的抑制效果最佳，其次是NaHSO3，EDTA抑制程度最低。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：臺(tái)灣青棗果實(shí)POD的最適pH值為5.8，當(dāng)pH值在5.0～7.4，相對(duì)酶活保持在80%以上，當(dāng)pH值低于3.0時(shí)，酶接近失活；臺(tái)灣青棗果實(shí)POD的最適溫度為40℃，低于20℃或高于50℃時(shí)，酶活性均明顯下降；該酶熱穩(wěn)定性較差，當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)15s時(shí)，酶活性幾乎鈍化。

3種抑制劑對(duì)臺(tái)灣青棗POD活性的抑制效果依次是：抗壞血酸>NaHSO3>EDTA。其中，抗壞血酸和NaHSO3對(duì)POD活性的抑制存在明顯的劑量效應(yīng)，當(dāng)抗壞血酸濃度為125mg/L、NaHSO3濃度為25g/L時(shí)，臺(tái)灣青棗果實(shí)POD活性幾乎被完全抑制?？紤]到食品的安全性，NaHSO3在食品中的添加應(yīng)執(zhí)行嚴(yán)格的限量。相比之下，抗壞血酸屬天然抗氧化劑，安全性高、抑制效果好，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可把抗壞血酸作為臺(tái)灣青棗果實(shí)POD的理想抑制劑。

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（責(zé)編：張宏民）