楊嵐 楊玲 李邦耀 李海明 楊寧寧 包慧 靳磊

摘 要：以寧夏6個不同產(chǎn)地的中國沙棘葉片為材料，對其黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行研究。采用超聲波法提取沙棘葉片中的黃酮類物質(zhì)，采用比色法對不同產(chǎn)地沙棘葉片中黃酮的含量及其抗氧化活性（DPPH自由基、銅離子還原能力和金屬鰲合能力）進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地沙棘葉片中黃酮含量差異顯著（P<0.05），其中含量最高的為隆德縣六盤山的中國沙棘，達(dá)到了566.09mg/100g，而彭陽縣中國沙棘葉片中黃酮類物質(zhì)含量最低，僅為151.58mg/100g；不同產(chǎn)地中國沙棘葉片黃酮提取物均具有一定的抗氧化活性，隆德縣神林鄉(xiāng)地區(qū)沙棘黃酮提取物對DPPH自由基清除能力最強，固原市中國沙棘黃酮提取物的銅離子還原能力最強，而其金屬離子鰲合能力最強的為隆德縣六盤山中國沙棘；中國沙棘葉片黃酮提取物具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑用于食品和醫(yī)藥，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。與此同時，不同產(chǎn)地中國沙棘葉片黃酮的含量及其抗氧化活性均存在顯著性差異，因此，在中國沙棘開發(fā)利用時對優(yōu)良種源的篩選非常必要。

關(guān)鍵詞：沙棘葉；總黃酮；提取工藝；抗氧化

中圖分類號 S793 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）14-0022-04

Study on Flavonoid Content and Antioxidant Activity of Hippophae Rhamnoides from Different Areas in Ningxia

Yang Lan1 et al.

（Agriculture School of Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract：With Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis leaves from 6 different producing areas in Ningxia as material，the project investigated the best extractive process and the antioxidant activity of the flavonoid substance. Ultrasonic method was adopted to extract the flavonoid substance in sea-buckthorn leaves，and colorimetric method was used to measure and analyze the content of flavonoid substance in sea-buckthorn leaves and the antioxidant activity （DPPH free radical，reduction capacity of cupric ion and metal-chelating capacity）. The content of the flavonoid substance in sea-buckthorn leaves of different producing areas has significant difference （P<0.05），among which the Chinese sea-buckthorn in Liupan Mountain of Longde County has the highest content of the flavonoid substance，reaching 566.09mg/100g，while the Chinese sea-buckthorn in Pengyang County has the lowest content of the flavonoid substance，reaching 151.58mg/100g. And the flavonoid substance in Chinese sea-buckthorn leaves from different producing areas have a certain antioxidant activity. The flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Shenlin District，Longde County has the strongest free radical scavenging capacity，the cupric ion in the flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Guyuan City has the strongest reduction capacity，while the flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Liupan Moutain of Longde County has the strongest metal-chelating capacity. The flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves has good antioxidant activity，therefore it can serve as natural antioxidant used in food and pharmaceutical industry. Furthermore，both the content of the flavonoid substance in Chinese sea-buckthorn leaves in different producing areas and the antioxidant activity have significant difference. Therefore，it is very necessary to screen excellent provenance in developing and utilizing Chinese sea-buckthorn.

Key words：Seabuckthorn leaves；Total flavonoids extraction process ；Antioxidant

中國沙棘（Hippophae rhamnoides L.subsp.sinensis）為胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（Hippophae）落葉性灌木，為藥食同源植物。中國沙棘適應(yīng)性強、生長快、耐干旱、抗風(fēng)沙、保水土，還有很強的固氮能力，對生態(tài)起著很好的修復(fù)作用[1～2]。隨著人們對合成抗氧化劑使用安全的質(zhì)疑，尋找安全高效的天然抗氧化劑已成為食品添加劑的一個重要研究方向。而沙棘中含有豐富的黃酮類成分，以往對黃酮類物質(zhì)提取的研究主要集中在果實和果渣中，而對黃酮含量更為豐富的沙棘葉研究卻較少，但是沙棘葉資源豐富，一年四季均可采摘，干燥保存方便，加工提取技術(shù)相對簡單，且用沙棘葉提取黃酮，不影響果實等的加工利用，具有更大的開發(fā)和應(yīng)用的空間[3]。沙棘的根、莖、葉、花、果，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、航天、農(nóng)牧漁業(yè)等國民經(jīng)濟的許多領(lǐng)域[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，沙棘可降低膽固醇，緩解心絞痛，還有防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用[5]。而黃酮類化合物是1種廣泛存在于植物中的刺激代謝產(chǎn)物，具有擴張血管、防御病原體、抗氧化、抗炎、抗癌、增加免疫力及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種生物活性[7]。本研究以寧夏不同產(chǎn)地的中國沙棘葉為材料進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝以及抗氧化性能的研究，發(fā)掘沙棘潛在的生物保健功能，為沙棘資源在醫(yī)藥，食品及保健品行業(yè)的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)，也為發(fā)現(xiàn)高效、安全的天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集及處理

1.1.1 材料采集地點 中國沙棘葉片于2015年6月，采自寧夏西吉縣、隆德縣、海原縣等地，具體信息見表1。

1.1.2 材料處理

1.1.2.1 沙棘葉粉碎過篩 將不同產(chǎn)地采集的中國沙棘葉片陰干、除雜后，粉碎，分別稱取20.00g混合，用于黃酮含量及抗氧化活性的測定。

1.1.2.1 材料去脂 取沙棘粉末30g，加入150mL正己烷[8]，常溫攪拌1h后真空抽濾，洗滌數(shù)次，至濾液無色，濾渣常溫干燥。

1.2 試劑及儀器 福林–酚試劑購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；沒食子酸、蘆丁、兒茶素、新亞銅、菲洛嗪、DPPH自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、水溶性維生素E（Trolox）購于美國Sigma公司。色譜甲純、無水碳酸鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、香草醛、鹽酸、硫酸銅、醋酸鈉，硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、大豆卵磷脂、磷酸鈉、氯化鐵、抗壞血酸、羥甲苯丁酯、硫代巴比妥酸、氯仿、氯化亞鐵購于天津博迪化工有限公司。

UV-4803型紫外可見光分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；KDC-140HR低溫冷凍離心機：安徽中科科學(xué)儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮含量測定

1.3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10mg，置于50mL容量瓶中，加入60%的乙醇適量，超聲使其溶解，再加入60%的乙醇，稀釋至刻度，搖勻，即得0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.1.2 中國沙棘葉片中總黃酮含量的測定 對寧夏不同產(chǎn)地的中國沙棘葉片黃酮類物質(zhì)含量進(jìn)行測定，精密吸取沙棘提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL的容量瓶中，加60%乙醇至6mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%的硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%的氫氧化鈉溶液10mL，加60%的乙醇至刻度，搖勻，放置10min。以相應(yīng)的試劑作空白（即不加沙棘提取液，直接量取60%乙醇6mL按上述步驟進(jìn)行試驗），分光光度計于510nm波長下測定其吸光度[9]，然后帶入回歸方程得到提取液的黃酮質(zhì)量濃度，進(jìn)而得到沙棘葉中黃酮的含量，結(jié)果以mg/100g表示。得到回歸方程：y=1.1555x+0.0105，R2=0.9996。式中：x為吸光度；y為樣品濃度。黃酮含量的計算公式為：提取含量（mg/100g）=CV/m。式中：C為提取液的總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；m為稱取實驗材料的質(zhì)量。

1.3.2 中國沙棘葉片中黃酮類物質(zhì)抗氧化活性的測定

1.3.2.1 銅離子還原能力的測定（CUPRAC） 參考Apake等的方法，略有改動[10]。吸取0.1mL中國沙棘片葉黃酮提取液，依次加入硫酸銅（5mmol/L）、新銅試劑（3.75mmol/L）和醋酸銨（1mol/L，pH=7.0）緩沖液各1mL，最后加入1mL水，總反應(yīng)體系為4.1mL，反應(yīng)30min分光光度計于450nm比色，結(jié)果以每百克沙棘葉黃酮中所含的水溶性維生素E（Trolox）物質(zhì)的量（μmol/100g）表示。

1.3.2.2 清除DPPH自由基活性的測定（HRSA） 參考Brand-Williams等的方法，略有改動[11]。精確稱取12.50 mgDPPH溶于甲醇中，定容至100mL，其濃度為125mg/L，使用之前稀釋5倍，現(xiàn)配現(xiàn)用。將0.1mL中國沙棘葉黃酮提取液加到3.9mL DPPH甲醇溶液中，避光反應(yīng)30min，在分光光度計于515nm處測定其吸光值，對照以相同體積的甲醇代替樣品，結(jié)果以每百克沙棘葉黃酮中所含的水溶性維生素E（Trolox）物質(zhì)的量（μmol/100g）表示。

1.3.2.3 金屬離子鰲合能力（MCC） 參考Dinis等的方法，略有改動[12]。取10mL試管，依次加入1mL中國沙棘葉片黃酮提取液、50μL氯化亞鐵溶液（2mmol/L）、0.15mL菲洛嗪工作液（2.5mmol/L）和3.8mL的蒸餾水。反應(yīng)10min后在562nm處測定其吸光值，結(jié)果以鰲合鐵離子%表示。