趙慧軍 康雅娟 李建鵬 李志忠

1. 蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅、蘭州，730000；2.蘭州理工大學(xué)，甘肅、蘭州，730000

引言

灰霉病是由半知菌亞門、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害[1]，其分生孢子萌發(fā)侵染性強、可感染多種果蔬，引起植株枯萎、根部及果實腐爛、莖稈壞疽[2]，不僅嚴重危害果蔬的生長，也影響果蔬運輸過程中的防腐保鮮。當前灰霉病的防治主要采用化學(xué)防治為主，配合農(nóng)業(yè)防治措施，輔以使用微生物菌劑，但不可避免的環(huán)境污染、健康問題及作物病蟲害抗性等日益嚴重[3]。

隨著灰霉病生物防治 的廣泛深入研究，植物病害生物防治的優(yōu)勢凸顯，尤其是其生態(tài)效益和安全性。研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉孢子懸液、羅倫隱球酵母細胞、放射腐霉、地衣芽孢桿菌、熒光假單胞菌等生防菌都能有效的抑制草莓灰霉菌的生長及侵染[4]。芽孢桿菌由于其對熱、紫外線、輻射和化學(xué)藥劑的強耐受性和抗性[5]，及其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用引起關(guān)注，研究表明，芽孢桿菌作為植物體內(nèi)常見內(nèi)生細菌，其抗菌物質(zhì)可拮抗多種植物病原菌。植物病原菌在不同的地域及生長環(huán)境中表現(xiàn)出不同的致病性及遺傳學(xué)，因此，從靶向區(qū)域作物根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)中篩選優(yōu)勢拮抗菌，更能實現(xiàn)生物防治的靶向性及長效性[5]。

甘肅省蘭州市紅古區(qū)作為綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化示范區(qū)，土壤氣候條件適合多品種草莓種植。本實驗通對紅古區(qū)花莊鎮(zhèn)草莓標準化生產(chǎn)基地的調(diào)查采樣，從感染灰霉病的草莓果實、根際土壤中分離得到芽孢桿菌26株，通過抑菌實驗篩出對草莓灰霉菌具有較強抑菌和拮抗作用的芽孢桿菌，并進行菌種誘變得到2株具有穩(wěn)定抗病能力的菌株，通過生物學(xué)特征檢測和分子鑒定，為后續(xù)草莓灰霉病的生物防治提供了研究基礎(chǔ)[5]。

1. 材料與方法

1.1 材料

實驗中植物病原菌草莓灰葡萄孢菌（Botrytis sp. isolate NO_9）由課題組從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)灰霉病高發(fā)區(qū)病果中分離鑒定保藏。拮抗菌HZ12和 HZ02從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)病果根際土壤分離純化保藏。

1.2 試劑

牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基；牛肉膏液體培養(yǎng)基；馬鈴薯培養(yǎng)基；DNA提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）；DNA 電泳上樣緩沖液（日本TaKaRa 公司）；Taq 酶（日本TaKaRa 公司）；100 DNA Ladder Marker（北京艾德萊生物科技有限公司，DM1001）；瓊脂糖（西班牙Biowest 公司）；DNA 膠純化試劑盒（購自AXYGEN 公司）；引物（invitrogen）。

1.3 試驗方法

1.3.1 拮抗菌的形態(tài)觀察

將拮抗菌接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基，35℃，160r/min發(fā)酵培養(yǎng)12h,用無菌水制備菌懸液，稀釋后涂布平板，35℃培養(yǎng)12h,觀察單菌落形態(tài)。

1.3.2 拮抗菌的生理生化檢測

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[7]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]和《微生物鑒定手冊》[9]對拮抗菌進行生理生化指標檢測。

1.3.3 拮抗菌分子鑒定

拮抗菌的DNA提取使用細菌基因組DNA提取試劑盒，PCR擴增16srDNA,采用25μl擴增體系（見表1-2）?；厥諗U增片段，委托南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成測序。

表1 PCR 反應(yīng)體系的組成

表2 PCR 反應(yīng)程序

1.3.4 拮抗細菌對草莓灰霉菌抑菌作用研究

1.3.4.1 拮抗菌對草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

將拮抗菌置于液體培養(yǎng)基中，37℃搖床160r/min震蕩培養(yǎng)24h。發(fā)酵液12000r/min離心10min，上清液用0.22μm細菌過濾器過濾制備無菌濾液；分離得到的菌體用無菌生理鹽水洗滌3次制成菌懸液備用。挑取培養(yǎng)5d的灰霉菌絲接種到PDA平板培養(yǎng)基中心，25℃恒溫培養(yǎng)12h后進行抑菌試驗[10-11]。

采用杯碟法進行抑菌活性測定：PDA平板培養(yǎng)基放置3個牛津杯，分別加入100μl拮抗菌發(fā)酵液、拮抗菌發(fā)酵無菌濾液、拮抗菌菌懸液。25℃恒溫培養(yǎng)48h后側(cè)抑菌圈[12-13]。

1.3.4.2 拮抗菌對草莓灰霉病菌絲的破壞作用

對灰葡萄孢菌正常生長菌絲和對峙生長邊緣菌絲制備樣品[14］，掃描電鏡觀察。

1.3.4.3 拮抗菌對草莓灰葡萄孢菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

將培養(yǎng)5d的灰霉平板用0.3%吐溫80洗脫收集孢子，配置濃度為1.0×106個/ mL的孢子懸液，各取200μl孢子菌懸液和800μL細菌發(fā)酵濾液液加入EP管中充分震蕩，對照組取200μl孢子菌懸液和800μL無菌水；分別25℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察孢子萌發(fā)狀態(tài)，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率[15]。

2. 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的形態(tài)特征

菌株HZ12單菌落圓形，白色不透明（圖1），菌落干燥，邊緣光滑，中間稍隆起，表面有褶皺（圖5-6）；油鏡鏡檢，革蘭氏染色陽性，細胞呈桿狀，形成橢圓形中生芽孢[10]（如圖3）。菌株HZ02單菌落白色不透明（圖2），成片菌落呈黏稠狀，表層光滑濕潤，中間稍隆起，邊緣不規(guī)則（圖7-8）；菌體均為橢圓形、短桿狀，革蘭氏陽性菌，形成內(nèi)生芽孢（如圖4）。

圖1 HZ12菌落

圖2 HZ02菌落

圖3 HZ12菌體掃描電鏡

圖4 HZ02菌體掃描電鏡

圖5 HZ12單菌落

圖6 HZ12單菌落

圖7 HZ02單菌落

圖8 HZ02單菌落

2.2 拮抗菌的生理生化特征測定結(jié)果

如下表結(jié)果所示，菌株HZ12和HZ01均為好氧菌，均能耐受10%NaCl，接觸酶、淀粉水解、明膠水解、糖醇發(fā)酵實驗均為陽性；葡糖糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、半乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，果糖、乳糖、棉子糖不產(chǎn)酸。

表3拮抗菌生理生化特征測定結(jié)果

2.3 拮抗菌16rS序列分析

菌株HZ12、HZ02的DNA進行PCR擴增，得到目標條帶1-2號（如圖7），經(jīng)測序，菌株HZ12、HZ02的序列分長度分別為1454bp、1445bp。將16s rDNA序列與Genbank中的相關(guān)序列進行BLAST比較，并采用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，菌株HZ12與 Bacillus subtilis subsp. subtilis strain DSM 10（KJ812207.1 ）序列相似度達到 99%(如圖8);菌株HZ02與Bacillus amyloliquefaciens strain(KU879248.1 )相似性最高，序列相似度達到 100%（如圖9）。

圖8：菌株HZ1216S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9：菌株HZ0216S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 拮抗細菌對草莓灰霉菌的抑制作用

2.4.1 拮抗菌對草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

采用杯碟法檢測拮抗菌株對草莓灰葡萄孢菌的抑制作用，圖10顯示，以無菌水為對照，菌株HZ12和HZ02具有較強的抑菌作用；發(fā)酵液抑菌試驗培養(yǎng)3d 后，抑菌圈直徑均在10-25 mm，抑菌效果較為穩(wěn)定（圖11-12）。如圖13-14所示，抗菌發(fā)酵液、拮抗菌發(fā)酵無菌濾液、拮抗菌菌懸液對灰霉菌均有抑制作用，發(fā)酵液與菌懸液的抑制效果最好，發(fā)酵無菌濾液的抑制效果較弱。說明拮抗菌對灰霉菌的抑制作用主要來源于菌體。

圖10拮抗菌對照實驗

圖11 HZ12菌株

圖12 HZ02菌株

圖13 菌株HZ12拮抗實驗：A發(fā)酵液 B菌懸液C無菌濾液

圖14菌株HZ02拮抗實驗：A發(fā)酵液 B菌懸液C無菌濾液

表4 拮抗菌對灰霉菌的抑制作用

2.4.2 拮抗菌對草莓灰葡萄孢菌菌絲的抑菌作用

抑菌圈邊緣菌絲表現(xiàn)出一定的畸形：菌絲變粗，扁平出現(xiàn)褶皺，菌絲斷裂。正常培養(yǎng)的菌絲光滑、細長均勻?？梢娋闔Z12和HZ02可抑制灰霉菌絲的生長。

圖15正常生長菌絲

圖16 菌株HZ12擴散培養(yǎng)邊緣菌絲

圖17 菌株HZ02擴散培養(yǎng)邊緣菌絲

2.4.3 拮抗菌對草莓灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

如圖18-20所示，添加了拮抗菌發(fā)酵濾液的灰霉孢子萌發(fā)率低，菌絲生長出現(xiàn)畸形：多核，細胞內(nèi)容物出現(xiàn)凝聚、空洞，菌絲粗短等?；颐规咦釉?%的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,萌發(fā)率穩(wěn)定的保持在90%以上，平均達到94.72；添加拮抗菌發(fā)酵上清液的孢子懸液中，菌株HZ12處理的萌發(fā)率不超過14%，菌株HZ02處理的萌發(fā)率不超過18%；兩株拮抗菌對灰霉孢子的萌發(fā)有較強的抑制作用。

圖18 PDB孢子萌發(fā)液

圖 19 添加HZ12發(fā)酵液的孢子萌發(fā)液

圖20 添加HZ02發(fā)酵液的孢子萌發(fā)液

表5拮抗菌對灰霉孢子的萌發(fā)抑制作用

3. 結(jié)論與討論

綜上所述，從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)病果根際土壤篩選到的兩株細菌，通過對分離純化的菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定、生物學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)同源性比較，菌株HZ12鑒定為枯草芽孢桿菌，菌株HZ02 為解淀粉芽孢桿菌。菌株HZ12、HZ02 對灰霉均有較好的抑制作用，可致使菌絲生長出現(xiàn)多核、空洞，菌絲粗短，生長緩慢；灰葡萄孢子萌發(fā)率從＞90%降低到＜18%，很大程度上減少了灰霉菌的感染率。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的抗病機制主要是與致病菌競爭營養(yǎng)和空間位點、分泌脂肽類化合物、有機酸、水解酶等抑菌物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等[16-21］。本研究將繼續(xù)對兩株拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、抑菌活性物質(zhì)的分離純化，抑菌物質(zhì)對灰葡萄孢菌的抑制作用機理和安全性能等方面進一步深入研究。