章安源，李有志，張傳津，張呈軍，劉道中

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室，濟南 250022)

麻杏石甘口服液是由麻黃、杏仁、石膏、甘草這4味中藥經(jīng)過現(xiàn)代提取工藝而成的口服液制劑。麻黃為本方的君藥，所含有效成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿為擬腎上腺類藥物，是國家規(guī)定的需要嚴格控制的毒、麻類藥品[1]，具有發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫的作用。且近年來有關(guān)麻黃生物堿類毒副作用報道日趨增多[2]，嚴格控制含量勢在必行?？嘈尤受帐强嘈尤实闹饕行С煞郑箍绕酱?，協(xié)助麻黃，為佐藥[3]?！吨袊F藥典2015年版二部》僅有薄層色譜技術(shù)鑒別麻黃堿及甘草的存在與否，缺少麻黃和苦杏仁兩種主藥成分含量控制指標，目前尚未有應用HPLC同時檢測麻杏石苷口服液中各組分的報道，建立一種快速、可靠、易行的檢測方法具有十分重要意義。研究首次建立HPLC在同一色譜體系中對其含量測定方法，可更好控制本制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀Waters 2695 (配二極管陣列檢測器2998)；AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；KQ - 250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；

1.2 試藥與試劑 鹽酸麻黃堿(批號：171241 - 201007，含量99.7%)；鹽酸偽麻黃堿對照品(171237-201510，含量99.8%)；苦杏仁苷對照品(110820-201607，含量90.7%)；均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(Merck, 色譜純，) 磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 檢測方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為waters Eclipso XDB-118 C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%磷酸溶液 (含0.3%三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)[2]，按表1進行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫為30 ℃。檢測波長范圍210 nm。

1.3.2 陰性對照溶液 按麻杏石甘口服液處方比列精確稱取藥材(麻黃、杏仁除外)，按照制備工藝制成陰性樣品溶液后[4]，照“2.2.3”項下方法處理制成空白樣品溶液。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

1.3.3 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷對照品適量，加初始比列流動相配制成濃度為200 μg/ml的混合對照品溶液。0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.4 標準工作液的制備 取適量2.2.1項下溶液，用初始流動相稀釋，制備成系列濃度為：0.5、1、5、12.5、25、50、100、200 μg/mL標準工作液，繪制標準曲線。

1.3.5 供試品溶液制備 取樣品充分振搖，混勻，精密量取 1 mL，置 25 mL量瓶中，加初始流動相至刻度，超聲(120 W，40 kHz)處理 30 min，放冷，用流動相補足至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得[5]。

1.3.6 陽性添加樣品 精密量取1.3.2項下陰性樣品溶液2 mL，分別精密加入各成分對照品，平行6份，混合均勻，按1.3.5項下方法制成陽性添加樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 通過陰性對照溶液和陽性添加試驗排除各制劑中主要成分與輔料對被測物的干擾。分別精密量取1.3.2、1.3.3、1.3.5項下溶液各10 μL,照1.3.1項下色譜條件，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，混合對照品溶液中鹽酸麻黃堿的保留時間約為8.289 min，鹽酸偽麻黃堿與苦杏仁苷的保留時間約為10.294、40.683 min，與供試品三組峰出峰時間相吻合，峰分離度好，輔料峰也不在三組成分峰處出峰(圖1～圖3)。

圖1 混合對照品溶液 (1鹽酸麻黃堿，2鹽酸偽麻黃堿3苦杏仁苷)Fig 1 Mixed control solution

圖2 供試品溶液Fig 2 sample solution

圖3 陰性對照溶液Fig 3 Negative contrast solution

2.2 方法線性考察 分別精密量取1.3.4項下各濃度工作液20 μL，照1.3.1項色譜條件下注入儀器，以濃度(μg)為橫坐標(X),，峰面積為縱坐標(Y)，計算回歸方程Y鹽酸麻黃堿=19612X+9440.4，R2=0.9993；Y鹽酸偽麻黃堿=20095x+949.14,R2=0.9997； Y苦杏仁苷=6714x-29014,R2=0.9992。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿在0.5～200 μg/mL，苦杏仁苷在5～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)與其對應的峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL注入色譜儀，連續(xù)進樣6次。以峰面積計算，得出鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，杏仁苷的RSD分別為2.23%，2.52%， 3.02%。表明儀器精密度良好，符合檢測要求。

2.4 重復性試驗 同批供試品( 批號為 20180101，山東某獸藥生物科技有限公司提供) ，按1.3.5項下制備6份樣品溶液，分別注入液相色譜儀，計算鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷含量，RSD分別為1.2%，1.6%、2.0%,說明該方法重現(xiàn)性好，含量穩(wěn)定。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取1.3.5項下同一供試品溶液(批號：20180101)，室溫下每隔3 h連測8次，進樣體積20 μL，鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷峰面積RSD分別為0.81%，0.82%、0.92%，表明本制劑在制備后的24 h內(nèi)成份較穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗 取1.3.6項下溶液2 mL，按1.3.1項下條件測定鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷含量?；厥章试?0.24～92.16%之間，變異系數(shù)在0.53%～3.20%之間，結(jié)果見表2～表4。表明該方法回收率較好，準確度和精密度可以滿足檢測需求。

表2 鹽酸麻黃堿回收率試驗(n=6)Tab 2 The resultof the recovery rate of ephedrine hydrochloride

表3 鹽酸偽麻黃堿回收率試驗(n=6)Tab 3 The resultof the recovery rate of pseudoephedrine hydrochloride

表4 苦杏仁苷回收率試驗(n=6)Tab 4 The resultof the recovery rate of amygdalin

2.7 樣品測定 按照1.3.5項下條件配制不同批號供試品溶液，進樣，測定，計算。結(jié)果見表5。該方法穩(wěn)定，適合檢測需求。

表5 樣品測定結(jié)果(n=6)Tab 5 The resultof the sample content

2.8 檢出限和定量限 “1.3.2”項下溶液色譜圖顯示無麻黃堿及苦杏仁苷及其他成分干擾，分別添加濃度2.5 μg/mL鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品，12.5 μg/mL苦杏仁苷對照品，顯示信噪比(S/N)>3，故確定為方法的檢出限。添加濃度12.5 μg/mL鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對照品，65 μg/mL苦杏仁苷對照品，信噪比(S/N)>10，作為此方法定量限。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動相的選擇 苦杏仁苷和麻黃堿的測定中，流動相的使用有多種，由于苦杏仁苷和麻黃堿在207、210 nm波長分別有最大吸收波長，但是甲醇在210 nm的末端波長處有少量紫外吸收，對準確測定結(jié)果具有一定的影響，改用在末端波長吸收較小的乙腈替換甲醇做流動相，基線更加平穩(wěn)[6]。故考察以下5種有機相成分為乙腈的組成及比列：乙腈-0.1%磷酸溶液(5∶95)[7]、乙腈-0.2%磷酸溶液(5∶95)[8]、乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)Ph3.0)(4.5∶95.5)[9]、乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(10∶90)[10]、乙腈-1%磷酸(3∶97)[11]。優(yōu)化篩選后發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液流動相中添加0.3%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，可使制劑中麻黃堿和偽麻黃堿分離良好，峰形佳，并無拖尾及其它雜質(zhì)峰的干擾。此外，為了擴大方法的適用范圍，綜合考慮苦杏仁苷的出峰時間不能太晚且與其它物質(zhì)能完全分離，采用了梯度洗脫，論證了三組不同比例乙腈-0.1磷酸溶液對苦杏仁苷峰的影響，使用流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(8∶92)梯度洗脫,流速控制在0.8 mL/min，與雜質(zhì)峰分離度較好，峰形對稱。故此流動相能夠使待測三種成分較好分離，分析時間控制在55 min內(nèi)，準確度高，重現(xiàn)性好。

3.2 色譜柱的選擇 《中國獸藥典》2015年版二部中要求麻黃項下對麻黃堿偽麻黃堿測定中使用極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱，造價高，未使用。使用不同型號的ZORBAX SB C18[12]、(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Wonda-Sil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)[6]， Waters Eclipso XDB-118 C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)進行比較，后者普通C18柱即可滿足三組成分同時進行測定的需求。

3.3 供試品溶液前處理 供試品溶液的制備過程中先后使用1 mol/L鹽酸-20%乙醇(1∶10)萃取[13]； AB-8大孔樹脂(內(nèi)徑10-15mm)水洗脫[14]；乙醚振搖[8]等提取方法、提取溶劑、提取時間進行考察；結(jié)果表明以上幾種處理方法繁瑣，重現(xiàn)性差?？紤]到麻黃堿及苦杏仁苷的溶解性，使用初始流動相超聲(功率120 W，40 kHz)處理樣品溶液30 min，樣品過濾后直接進樣，操作簡單，有效成分能夠較完全提取。符合中藥質(zhì)量評價偏向于樣品前處理簡單，重復性高，成本低、效率高的發(fā)展方向[15]。

3.4 柱溫的確定 對25 ℃，30 ℃，35 ℃柱溫進行比較試驗， 30 ℃柱溫時，基線平穩(wěn)，系統(tǒng)柱壓穩(wěn)定，出峰時間穩(wěn)定，因此30 ℃柱溫符合檢測要求。

3.5 結(jié)論 使用HPLC、UPLC同時測定中藥材中多種成分是控制質(zhì)量的有效方法之一[16-17]，建立的方法可以同時分離3種有效成分后進行定量分析，前處理快速準確，實用性強，可用于鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量測定，為快速有效地控制麻杏石甘口服液的質(zhì)量提供新的方法。