李 彥 更吉卓瑪 賈留坤 王智華 陳世龍 高慶波

(1.中國(guó)科學(xué)院高山植物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 3.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001)

青藏高原復(fù)雜的地理拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、特殊的自然環(huán)境以及豐富獨(dú)特的生物資源，使其成為全球25個(gè)生物多樣性重點(diǎn)保護(hù)地區(qū)之一[1]。研究表明，第四紀(jì)冰期與間冰期反復(fù)交替所引起的氣候波動(dòng)嚴(yán)重影響了該地區(qū)現(xiàn)有生物類群的地理分布和遺傳結(jié)構(gòu)[2～3]。山地虎耳草(SaxifragasinomontanaJ.T.Pan & Gornall)為虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草屬(SaxifragaL.)多年生草本植物，在我國(guó)主要分布于青海、甘肅、四川、云南及西藏等地，其生境多為海拔2 700～5 300 m的高山草甸、灌叢和石隙[4]，是青藏高原高寒草甸的重要組成部分，對(duì)維護(hù)該地區(qū)的生態(tài)平衡發(fā)揮著重要的作用。此外，山地虎耳草還具有藥用價(jià)值，其花入藥，可治頭痛、神經(jīng)痛等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和分析方法的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于虎耳草屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和譜系地理學(xué)研究[5～11]，以揭示北極和高山地區(qū)植物的分化模式。研究表明，山地虎耳草是虎耳草屬山羊臭組(Saxifragasubsect.CiliataeHaw.)中較為年輕的一個(gè)物種，其居群分化歷史小于5百萬(wàn)年甚至更短[6]，可能具有更復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)和第四紀(jì)冰期進(jìn)化歷史。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)或微衛(wèi)星(microsatellite)是一類由幾個(gè)核苷酸(2～6個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中，并利用重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在同一物種不同基因型間的差異來(lái)揭示物種的長(zhǎng)度多態(tài)性[12～14]。微衛(wèi)星作為一種共顯性表達(dá)分子標(biāo)記，具有數(shù)量多，長(zhǎng)度短，分布廣且均勻，多態(tài)性高，易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳多樣性分析，系統(tǒng)發(fā)育，遺傳圖譜構(gòu)建及分子育種研究等[15～17]。近年來(lái)，基于高通量測(cè)序?qū)η嗖馗咴貐^(qū)高山植物的遺傳多樣性研究也越來(lái)越多，例如唐古特紅景天[18]、藍(lán)玉簪龍膽[19]和西川紅景天[20]等，但是關(guān)于虎耳草屬植物還鮮有報(bào)道。

本研究基于山地虎耳草的高通量測(cè)序結(jié)果，利用MISA(MicroSatellite)軟件搜索該物種的SSR位點(diǎn)，通過(guò)分析其微衛(wèi)星重復(fù)序列特征，為山地虎耳草SSR標(biāo)記的開發(fā)和遺傳多樣性檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

山地虎耳草(S.sinomontana)采集于青海省玉樹藏族自治州玉樹縣小蘇莽鄉(xiāng)(32°34′20.7″N，97°12′41.6″E，4 880 m)。將野外采集的活體材料置于室內(nèi)種植68天，再采取同一叢植株上的葉片，放入冷凍管中，用液氮處理約15秒后放入-80℃冰箱保存。憑證標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(HNWP)。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

從山地虎耳草的葉片材料中提取100 μg總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的降解程度以及是否有污染，用Nanodrop初步檢測(cè)RNA的純度，最后分別選擇Qubit和Agilent 2100來(lái)精確定量RNA濃度并檢測(cè)其完整性。

樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集山地虎耳草的mRNA。之后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymeraseⅠ及RNase H合成雙鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads對(duì)其片段大小進(jìn)行選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol·L-1)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求混池后用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 質(zhì)量評(píng)估與拼接

對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，包括測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查；A/T/G/C含量分布檢查；對(duì)測(cè)得的原始讀序(Raw reads)進(jìn)行過(guò)濾：去除帶接頭(adapter)的和N比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量的reads，得到干凈的讀序(Clean reads)后，再用Trinity(版本：v2012-10-05；參數(shù)設(shè)置：min_kmer_cov為2，其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù))[21]對(duì)得到的Clean reads進(jìn)行拼接，并取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，以此進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 SSR的篩選和統(tǒng)計(jì)分析

以組裝出來(lái)的Unigene作為參考序列，使用MicroSatellite(MISA；版本：1.0；默認(rèn)參數(shù)；http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)、篩選和分析。檢索標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)包括精確型(perfect)及復(fù)合型(compound)SSR重復(fù)單元[22]，各重復(fù)微衛(wèi)星類型重復(fù)次數(shù)設(shè)定如下：兩堿基(di-nucleotide repeats，DNRs)至少重復(fù)6次，三堿基(tri-nucleotide repeats，TNRs)至少重復(fù)5次，四堿基(tetra-nucleotide repeats，TTNRs)至少重復(fù)5次，五堿基(penta-nucleotide repeats，PTNRs)至少重復(fù)5次，六堿基(hexa-nucleotide repeats，HXNRs)至少重復(fù)5次。并利用Excel(版本：Microsoft office 2016；默認(rèn)參數(shù))軟件對(duì)SSR的類型、數(shù)量及發(fā)生頻率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

對(duì)于RNA-seq技術(shù)，其測(cè)序錯(cuò)誤率會(huì)隨著測(cè)序序列長(zhǎng)度的增加而升高[23～24]，且單個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率一般低于1%。山地虎耳草高通量測(cè)序獲得94 855 756個(gè)Raw reads，過(guò)濾后獲得90 311 228個(gè)Clean reads，占Raw reads的95.21%，單堿基錯(cuò)誤率為0.035%，Q30值為88.98%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基的42.39%。

對(duì)山地虎耳草的Raw reads進(jìn)行處理后，用Trinity軟件對(duì)所得的Clean reads進(jìn)行組裝，最終獲得176 110個(gè)Transcripts和63 763個(gè)Unigene，并對(duì)二者的長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖1)，其中在拼接得到的Transcripts中N50為1 708，N90為465；在拼接得到的Unigene中N50為1 295，N90為276，其總的核苷酸數(shù)分別為189 919 691個(gè)、46 218 250個(gè)。

圖1 拼接后的Transcript與Unigene長(zhǎng)度分布圖Fig.1 The length distribution of Transcript and Unigene after assemblage

2.2 山地虎耳草SSR頻率及其分布

采用MISA對(duì)Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)，共檢出含有SSR的序列為7 700條，發(fā)生頻率為12.08%，其中6 454條序列含有單個(gè)SSR，1 246條序列含有1個(gè)以上的SSR。此外，共檢測(cè)出4 622個(gè)SSR，包括4 098個(gè)完全型SSR和524個(gè)復(fù)合型SSR，其發(fā)生頻率為7.25%(檢測(cè)出的SSR數(shù)量與總序列數(shù)目的比值)。從分布情況來(lái)看，山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組序列中平均每10.00 kB出現(xiàn)一個(gè)SSR。

對(duì)SSR類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，二至六核苷酸重復(fù)類型均有出現(xiàn)，其種類較為豐富，但各類型出現(xiàn)的頻率和分布的平均距離相差較大。其中三核苷酸重復(fù)類型的SSR含量最多，占總SSR的55.50%；其次為二核苷酸重復(fù)類型，所占比例為30.23%；其他類型(四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復(fù)合核苷酸重復(fù))所占比例較小，分別為2.25%、0.41%、0.28%和11.34%，總計(jì)14.28%。從分布情況來(lái)看，不同重復(fù)基元SSR分布的平均距離差別較大，其中三核苷酸重復(fù)最多，出現(xiàn)頻率為4.02%，每條SSR分布的平均距離為18.02 kB，六核苷酸重復(fù)最少，出現(xiàn)頻率為0.02%，平均距離為3 355.25 kB(表1)。

表1山地虎耳草SSR序列的出現(xiàn)頻率

Table1FrequencyofSSRsequencesofS.sinomontana

重復(fù)基元類型Repeat type數(shù)量Number比例Proportion(%)頻率Frequency(%)平均距離Average distance(kB)二核苷酸Di-nucleotide139730.232.1933.08三核苷酸Tri-nucleotide256555.504.0218.02四核苷酸Tetra-nucleotide1042.250.16444.41五核苷酸Penta-nucleotide190.410.032432.54六核苷酸Hexa-nucleotide130.280.023355.25復(fù)合Compound52411.340.8288.20合計(jì)Total46221007.2510.00

注：比例.各核苷酸SSR在總SSR中所占比例；頻率.含有SSR的序列數(shù)目與總序列數(shù)目的比值；平均分布距離.序列總長(zhǎng)度與SSR數(shù)目之比值 下同。

Note:Proportion. Proportion in all SSRs; Frequency. The percentage of SSR number in all sequences; Average distance. Ratio of total sequence length and SSR number The same as below.

2.3 山地虎耳草SSR基元類型和比例

在山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組4 098個(gè)完全型SSR中共發(fā)現(xiàn)了110種重復(fù)基元， 其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元分別有6、30、42、19和13種，占總SSR的比例范圍為0.02%～11.27%。

表2 山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組中不同SSR序列的出現(xiàn)情況

在二核苷酸重復(fù)基元中，AG/TC(521個(gè))出現(xiàn)次數(shù)最多，為二堿基的優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元，占二核苷酸重復(fù)基元SSR總數(shù)的37.29%，其次為AT/TA(346個(gè)，占24.77%)、CT/GA(292個(gè)，占20.90%)、AC/TG(131個(gè)，占9.38%)、CA/GT(101個(gè)，占7.23%)，CG/GC(6個(gè)，0.43%)。其中，AG/TC也是所有2～6核苷酸重復(fù)基元中數(shù)量最多的SSR，占總SSR的11.27%。三核苷酸重復(fù)基元中，AAG/TTC(233個(gè))出現(xiàn)頻率最高，占三核苷酸重復(fù)基元的9.08%，即三堿基的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，其次為CTT/GAA(202個(gè)，占7.88%)、AAC/TTG(180個(gè)，占7.02%)、AGA/TCT(164個(gè)，占6.39%)。四核苷酸重復(fù)類型中，AAGA/TTCT(8個(gè))出現(xiàn)頻率最高為7.69%，其次是AGAA/TCTT和CAAA/GTTT，二者均為6個(gè)，出現(xiàn)頻率均為5.77%，AACA/TTGT(5個(gè)，占4.81%)，其他類型出現(xiàn)頻率較低。五核苷酸和六核苷酸中各重復(fù)基元的個(gè)數(shù)均為1，出現(xiàn)頻率普遍偏低，分別占相應(yīng)重復(fù)類型的5.26%、7.69%(表2)。

2.4 山地虎耳草SSR重復(fù)次數(shù)分布

在SSR中，基元重復(fù)次數(shù)差異而引起的位點(diǎn)長(zhǎng)度變化是產(chǎn)生SSRs位點(diǎn)多態(tài)性的主要原因[25～26]。通過(guò)對(duì)山地虎耳草4 098個(gè)完全型SSR進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR數(shù)量逐漸減少。且山地虎耳草SSR重復(fù)次數(shù)大部分分布在5～10次的較低重復(fù)次數(shù)基元中，共4 036個(gè)SSRs，占總SSR的98.49%，是山地虎耳草SSR的重要重復(fù)部分；11次、12次和14次為一般重復(fù)次數(shù)基元，分布有61個(gè)SSRs，占總SSR的1.49%；20次以上為較高重復(fù)次數(shù)基元，本研究中只出現(xiàn)了50次的重復(fù)，且僅含1個(gè)SSR。在5～11次重復(fù)中，發(fā)現(xiàn)重復(fù)基元以5次出現(xiàn)的頻率最高，有1 640個(gè)，占總SSR的40.02%。其次為6～8次重復(fù)，分別占總SSR數(shù)量的31.67%、16.42%、5.76%(圖2)。

圖2 山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)分布Fig.2 The distribution of repeat number of SSR in transcriptome of S.sinomontana

據(jù)統(tǒng)計(jì)，二核苷酸基元重復(fù)次數(shù)類型最多，有8種，其分布為6～12次和50次，共1 397個(gè)，其中6～9次重復(fù)為主要類型，共1 258個(gè)，占二核苷酸基元的90.05%；三核苷酸基元重復(fù)次數(shù)類型次之，有5種，其分布為5～8次和14次，共2 565個(gè)，以5～7次重復(fù)為主要類型，共2 536個(gè)，占三核苷酸基元的98.87%；四、五、六核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)分布分別是5～9、5～7和5～9次，其中5次重復(fù)最多。在這五種核苷酸基元中，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR數(shù)量所占比例都有逐漸減少的趨勢(shì)(圖3)。

圖3 山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)分布Fig.3 The distribution of repeat number of SSR for different repeat types in transcriptome of S.sinomontana

在所有堿基中二核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)類型多，跨度大，其中AG/TC跨度最大，重復(fù)次數(shù)類型為8種，其次是AT/TA和CT/GA，重復(fù)次數(shù)類型均為7種，AC/TG和CA/GT為6種，而CG/GC重復(fù)次數(shù)類型最少，僅有2種；三核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)類型和跨度次之，其中ATT/TAA跨度最大，重復(fù)次數(shù)類型為5種，其余有15種重復(fù)基元均出現(xiàn)了4種重復(fù)次數(shù)類型，占三核苷酸總重復(fù)基元的50%；四核苷酸重復(fù)基元中僅有14種重復(fù)基元出現(xiàn)了兩種重復(fù)次數(shù)類型，占四核苷酸總重復(fù)基元的33.33%，其余的重復(fù)基元僅有1種重復(fù)次數(shù)類型；在五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元中，均只有1種重復(fù)次數(shù)類型出現(xiàn)。

2.5 山地虎耳草SSR基元長(zhǎng)度分布及其多態(tài)性

山地虎耳草EST-SSR基元長(zhǎng)度區(qū)間為12～100 bp，其中最大的片段長(zhǎng)度為二核苷酸重復(fù)50次(100 bp)的SSR。從整體來(lái)看，其分布范圍較為集中，主要在12～30 bp(4 090個(gè)，占99.80%)，大于30 bp的SSR數(shù)量較少(8個(gè)，占0.20%)。在所有SSR中，最多的為15 bp長(zhǎng)度的SSR(1 529個(gè)，占37.31%)，并且均為5次重復(fù)的三核苷酸基元，其次為18、12、21 bp的基元長(zhǎng)度，分布情況分別為760個(gè)(18.55%)、627個(gè)(15.30%)、355個(gè)(8.66%)(圖4)。

圖4 山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR基元長(zhǎng)度分布Fig.4 SSR motif length distribution in transcriptome of S.sinomontana

表4山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型的基元長(zhǎng)度分布

Table4ThedistributionofmotiflengthofSSRfordifferentrepeattypesintranscriptomeofS.sinomontana

重復(fù)類型Repeat type長(zhǎng)度Length(bp)SSR數(shù)量Number of SSRsSSR所占百分比Percent of total SSR(%)二核苷酸Di-nucleotide1262744.881431522.551620814.89181087.7320785.5822533.792470.5010010.07三核苷酸Tri-nucleotide15152959.611865225.422135513.8424281.094210.04四核苷酸Tetra-nucleotide208581.73241716.352810.963610.96五核苷酸Penta-nucleotide251789.473015.263515.26六核苷酸Hexa-nucleotide30969.233617.694217.6954215.38

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SSR基序長(zhǎng)度大于等于20 bp時(shí)其多態(tài)性較高，長(zhǎng)度在12～20 bp時(shí)多態(tài)性中等，而長(zhǎng)度在12 bp以下時(shí)多態(tài)性極低[27]。本研究篩選得到的山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR的長(zhǎng)度均大于等于12 bp，其中12～19 bp的SSR有3 439個(gè)(83.92%)，這些SSR具有中等多態(tài)性；而大于等于20 bp的SSR有659個(gè)(16.08%)，這些SSR具有較高的多態(tài)性，所以推測(cè)本研究中山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR的多態(tài)性均在中等以上。此外，研究發(fā)現(xiàn)高級(jí)基元SSR的多態(tài)性普遍比低級(jí)基元的低[28]。本研究中二核苷酸和三核苷酸基元占總SSR的96.68%，在長(zhǎng)度大于等于20 bp的SSR中，包含低級(jí)基元二核苷酸、三核苷酸共523條，占長(zhǎng)度大于等于20 bp的所有SSR的79.36%，表明大部分山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR具有高多態(tài)性潛能(表4)。

3 討論

本研究從山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組63 763個(gè)Unigene中檢測(cè)出了4 622個(gè)SSR，平均分布距離為1/10.00 kB，與其他檢索二至六核苷酸重復(fù)基元SSR(即不包含單核苷酸的SSR)的植物相比，山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR的平均分布距離明顯高于冷蒿(1/18.46 kB)[29]、地黃(1/23.08 kB)[30]、杜仲(1/26.13 kB)[31]和馬鈴薯(1/40.06 kB)[32]等，與藍(lán)玉簪龍膽(1/9.97 kB)[19]、菊花(1/10.64 kB)[33]相差較小，但低于唐古特紅景天(1/8.52 kB)[18]、紅白忍冬(1/7.49 kB)[34]和刺梨(1/1.68 kB)[35]。由此表明，山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量比較豐富。此外，山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率為7.25%，與唐古特紅景天(7.1%)[18]的出現(xiàn)頻率較為接近，高于冷蒿(2.61%)[29]和藍(lán)玉簪龍膽(6.12%)[19]。出現(xiàn)這種差異可能與物種選擇、組裝方法、篩選軟件、SSR搜索的標(biāo)準(zhǔn)(如SSR重復(fù)基元的類型、重復(fù)次數(shù)和長(zhǎng)度等)及分析方法有關(guān)。

研究表明，大多數(shù)植物的SSR主要重復(fù)基元類型是二核苷酸和三核苷酸，但是主導(dǎo)重復(fù)基元的類型有所不同[36～37]。本研究發(fā)現(xiàn)，山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR的優(yōu)勢(shì)基元是三核苷酸重復(fù)，占總SSR的55.50%，其次為二核苷酸重復(fù)，占總SSR的30.23%，這與冷蒿[29]、唐古特紅景天[18]、藍(lán)玉簪龍膽[19]等植物的優(yōu)勢(shì)基元結(jié)果相一致。但在杜仲[31]、紅白忍冬[34]和芝麻[38]等植物中二核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)地位，在川西獐牙菜[36]、燈盞花[37]和半夏[39]等植物中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)共同為主導(dǎo)類型。以上這種主導(dǎo)重復(fù)基元的差別可能與物種的差異有關(guān)。有研究表明三核苷酸、六核苷酸SSR重復(fù)基序的突變情況，可能是一種有利于植物進(jìn)化的突變[40]，在山地虎耳草中以三核苷酸SSR為主體的分布可能是自然選擇的結(jié)果。此外，有研究指出轉(zhuǎn)錄區(qū)的三核苷酸基序?qū)ψ匀贿x擇機(jī)制表現(xiàn)出積極選擇作用，在編碼區(qū)由于受到重大突變壓力的影響而存在豐富的核苷酸重復(fù)基序[40～43]。即當(dāng)植物表現(xiàn)出某些抗逆性時(shí)三核苷酸重復(fù)分布較為豐富。我們推測(cè)，隨著第四紀(jì)冰期氣候的反復(fù)波動(dòng)，該物種產(chǎn)生了相應(yīng)的抵御與適應(yīng)機(jī)制，并形成了豐富特殊的三核苷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)。

被子植物和蕨類植物主要以AG/CT為二核苷酸的優(yōu)勢(shì)基元，而裸子植物以AT/AT為優(yōu)勢(shì)基元；雙子葉植物、蕨類植物和少數(shù)單子葉植物以AAG/CTT為三核苷酸的優(yōu)勢(shì)基元[29]。在山地虎耳草的SSR中，二核苷酸重復(fù)基元以AG/TC(521，37.29%)為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，三核苷酸重復(fù)基元中以AAG/TTC(233，9.08%)為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，這與地黃[30]、馬鈴薯[32]、刺梨[35]等研究結(jié)果相類似。范三紅[44]等認(rèn)為這種占優(yōu)勢(shì)的重復(fù)基元可能與其編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的使用頻率較高有關(guān)。

GC含量作為堿基序列的重要特征之一，反映了基因的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化信息，GC分布不均會(huì)導(dǎo)致基因不同，GC含量序列不同其性質(zhì)和功能也有差異[45]，而且在大多數(shù)植物中GC重復(fù)基元很少出現(xiàn)，例如在唐古特紅景天[18]和紅白忍冬[34]等植物中均未發(fā)現(xiàn)該重復(fù)基元，但在山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR中檢測(cè)到了6個(gè)GC重復(fù)基元，這種現(xiàn)象在大豆[14]、刺梨[35]、川西獐牙菜[36]中也均有出現(xiàn)。此外，多個(gè)研究指出GC重復(fù)基元可能與某特定的功能相關(guān)，SSR序列中GC含量的增加會(huì)使某些氨基酸序列的增加而獲得某些特定功能，如脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[22,46]。對(duì)于山地虎耳草來(lái)講，其適應(yīng)青藏高原高、寒、旱環(huán)境的特性是否與GC重復(fù)單元有關(guān)還需要后期研究來(lái)加以探討。

SSR位點(diǎn)多態(tài)性主要是由基元的重復(fù)次數(shù)和堿基數(shù)不同來(lái)決定的[39]。在山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組SSR中二核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)類型多，跨度大，其中AG/TC跨度最大，重復(fù)類型次數(shù)為8種，從6～12次，最高達(dá)50次，三核苷酸重復(fù)基元中ATT/TAA跨度最大，重復(fù)次數(shù)類型為5種，四、五、六核苷酸重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)類型較少，僅有1～2種。Gao等[47]研究表明重復(fù)次數(shù)與SSR的變異呈正相關(guān)，所以本研究中二核苷酸SSR應(yīng)具有更高的多態(tài)性[48]。

綜上所述，通過(guò)分析和挖掘山地虎耳草轉(zhuǎn)錄組序列中SSR的信息，可為今后該物種SSR標(biāo)記的開發(fā)和篩選奠定生物信息學(xué)基礎(chǔ)，使其更合理、更有效地應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和譜系地理學(xué)等研究，為第四紀(jì)氣候波動(dòng)對(duì)高山植物的遺傳多樣性影響及其演化歷史提供更有力的證據(jù)。此外，作為國(guó)家生態(tài)建設(shè)的戰(zhàn)略要地，青藏高原擁有著類型多樣的極端環(huán)境，如高寒缺氧、晝夜溫差大、日照強(qiáng)烈、多風(fēng)多雪、干旱貧瘠的土壤等，存在極大的脆弱性，所以通過(guò)物種遺傳多樣性的研究可以為高原生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)和相應(yīng)的保護(hù)策略，進(jìn)而推動(dòng)國(guó)家“一帶一路”戰(zhàn)略的實(shí)施。