劉紫英，黃 磊，袁 斌，劉小林，*，徐勝光，黃 濤

(1.宜春學院 化學與生物工程學院，江西 宜春 336000； 2.宜春第九中學，江西 宜春 336000； 3.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000； 4.昆明學院 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，云南 昆明 650214)

當前制約我國草莓規(guī)?；a(chǎn)的主要原因之一依然為連作障礙[1]，而連作障礙的主要原因是草莓自毒作用。草莓自毒引起土壤養(yǎng)分失衡和土壤微生物區(qū)系失調，同時根系分泌物中積累了大量有毒物質[2]，因此研究根系自毒物質對栽培作物產(chǎn)量的影響是當今研究的有效途徑[3]。草莓根系分泌物中有一些化感物質具有自毒作用[4]，而苯甲酸在化感物質中含量很高，毒性較強[5]。草莓根系自毒物質的加速降解或活性降低，會有助于控制草莓連作障礙的發(fā)生，篩選和開發(fā)微生物修復劑是解決作物連作障礙的熱點[6]。有研究表明，Erwineaherbicola[7]、Microbacteriumhydrocarbonoxydans[8]、Eubacteriumoxidoreducens[9]、Ochrobactrumsp.[10]等菌株可有效降解細菌。本研究篩選苯甲酸高效降解菌株，同時檢測其與草莓根腐病原的拮抗性，篩選到解毒抗菌雙重功能的菌株；探討利用細菌降解草莓自毒物質的可行性，為草莓連作障礙的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓的品種為威州草莓。

供篩選降解菌株的土樣：于2016年11月28日取自江西省宜春市袁州區(qū)宜春學院正大門前方兩個草莓種植大棚，其中連作10年和3年的草莓種植大棚均采取五點取樣法，每點取3個樣品，各取15份10～15 cm土樣。

F403尖孢鐮刀菌Fusarium.oxysporum(序列號MG515306)、F405腐皮鐮孢Fusariumsolani(序列號MG515307)、F407黃色鐮孢Fusariumculmorum(序列號MG515308)均為草莓根腐病病原，系宜春學院微生物實驗室保存的菌株。

1.2 主要試劑和儀器設備

供試苯甲酸分析純(天津永大化學試劑有限公司出產(chǎn))。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、2×EasyTaqPCR SuperMix、Marker 2000 ladder、16S rDNA擴增引物(27F: 5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′，1541R: 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)均購自生工生物工程有限公司。

PH100-DB00U-IPL數(shù)碼顯微鏡，江西鳳凰光學集團有限公司；TGL-16G臺式高速離心機，上海安亭科學儀器廠；752N紫外可見光分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；T100梯度PCR儀，Bio-Rad。

1.3 培養(yǎng)基

改良無機鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量為蒸餾水；pH為7.2。

1.4 降解菌株的富集和分離

采用富集培養(yǎng)的馴化方法，將連作10年草莓種植大棚地(L1、L2、L3、L4、L5)和連作3年草莓種植大棚地(R1、R2、R3、R4、R5)隨機取樣10 g后接種入苯甲酸作為唯一碳源的基礎無機鹽液體培養(yǎng)基中。濃度梯度：L1和R1為100 mg·L-1、L2和R2為200 mg·L-1、L3和R3為300 mg·L-1、L4和R4為400 mg·L-1、L5和R5為500 mg·L-1，兩個對照組不接入土樣。在前期進行預實驗篩選后，設定140 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，然后將平板涂布于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿于37 ℃培養(yǎng)72 h，然后挑取單個菌落，進行純化培養(yǎng)。

1.5 降解菌株的篩選與鑒定

1.5.1 初篩

平板涂布之后，觀察固體培養(yǎng)基菌落生長情況，將長勢較好的固體培養(yǎng)基菌落進行單菌落挑選實驗，每株菌重復3次，將篩選純化培養(yǎng)得到的菌株分別進行編號(L101、L102、……L501、L502、L503；R101、R102、R103……R501、R502、R503)。

1.5.2 復篩

將初篩獲得的降解菌株移接到三角瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸 100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量為蒸餾水；其苯甲酸濃度為1 000 mg·L-1，接種初篩降解菌(1×107cfu·mL-1，加上菌液濃度)量為每瓶1 mL，對照為1 mL無菌水，設定140 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，觀察其生長情況，檢測苯甲酸殘留量。

1.6 降解菌菌株對苯甲酸的降解測定

1.6.1 苯甲酸標準曲線的測定

取苯甲酸標準液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分別加入到100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水搖勻，然后用蒸餾水定容，以零管作參照對比，用石英比色杯在波長230 nm下分別測定其吸光度(D230)，以吸光度(D230)為縱坐標，橫坐標為苯甲酸標準液的濃度，繪制標準曲線。

1.6.2 樣品中苯甲酸殘留量的測定

在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)7 d的過程中，期間每隔24 h，取出5 mL培養(yǎng)液加入到10 mL無菌離心管中，8 000 r·min-1，25 ℃，離心8 min后過濾(0.22 μm)，去掉菌體即為待測液。選用紫外可見分光光度法，用石英比色杯裝待測液在波長230 nm下測定其吸光度(D230)，根據(jù)吸光度(D230)和苯甲酸標準曲線計算樣品中苯甲酸的殘留含量。

1.7 降解菌對草莓根腐病的皿內(nèi)拮抗作用

將復篩獲得效果最好的降解菌在LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)140 r·min-1，48 h后以10 000 r·min-1速度離心5 min，0.2 μm濾膜過濾得上清液備用。

F403尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum)、F405腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、和F407黃色鐮孢(Fusariumculmorum)接種于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)5 d，加入無菌水，刮下孢子混勻成孢子懸浮液(1×107mL-1)。將懸浮液加入100 mL融化冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后制成含根腐病原菌的PDA平板。

凝固后在含病原菌PDA平板中間用無菌打孔器打孔，并取已過濾的降解菌L501 100 μL，28 ℃培養(yǎng)5 d，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.8 降解菌的鑒定

對最佳降解菌株L501進行形態(tài)學和革蘭氏染色的微觀形態(tài)觀察，并測定其16S rDNA序列，選用通用引物進行PCR擴增，由生工生物工程公司進行測序分析。將測序結果提交NCBI網(wǎng)站的GenBank，采用BLAST比對，并用MEGA6.0軟件構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ算法，自展次數(shù)設定為1 000；結合《常見細菌鑒定手冊》鑒定菌株L501[11]。

2 結果與分析

2.1 降解菌株的篩選及對苯甲酸的降解率

由苯甲酸標準曲線得吸光度與苯甲酸濃度關系為：y=0.005x+0.006，R2=0.999(圖1)。由表1可以看出，分離純化出的67株菌株中有9株對苯甲酸均具有降解能力，分別為L203、L302、L403、L501、L502、R401、R402、R403、R503，其降解率在168 h時分別為13.3%、17.1%、43.2%、87.5%、40.8%、49.5%、46.1%、57.3%、42.7%，其中L501最高，為87.5%。

經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，9株降解菌對苯甲酸的降解率為13.3%～87.5%，說明從草莓根部土壤分離篩選出的菌株對苯甲酸具備有效降解能力。復篩結果表明，L501降解苯甲酸的能力最強，因而以L501做拮抗實驗和鑒定。

2.2 降解菌對草莓根腐病的皿內(nèi)拮抗作用

降解菌株L501的發(fā)酵液表現(xiàn)拮抗活性，結果如表2。其中，對F405腐皮鐮孢Fusariumsolani菌株的生長具有很強的抑制作用，拮抗圈直徑達15.0 mm，對F403尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum拮抗直徑為14.5 mm；降解菌株L501對草莓根腐病菌F407黃色鐮孢Fusariumculmorum拮抗直徑為11.0 mm；且透明度都很好。綜上，降解菌株L501對草莓根腐病有較好的抑制作用。

2.3 降解菌株L501的鑒定

L501在168 h時對苯甲酸的降解率達到最高，降解率為87.5%。形態(tài)學觀察表明，降解菌菌落為乳白色，近圓形，邊緣光滑濕潤，稍具小齒，齒，表面皺褶，中部隆起。光學顯微鏡下可以觀察到菌株為革蘭氏陽性菌，為短桿菌；芽孢中生，稍膨大(圖2)。

圖1 苯甲酸標準曲線Fig.1 Standard curve of benzoic acid

表1九株降解細菌對苯甲酸降解率及苯甲酸的殘留量

Table1Degradation rate of benzoic acid by 9 strains of degrading bacteria and residual benzoic acid

降解菌編號Number指標Score降解時間Degrading time/h24487296120144168L501殘留量Residual content/(mg·L-1)375.9256.0247.0206.5170.5118.062.5降解率Degrading rate/%24.848.850.658.765.976.487.5L502殘留量Residual content/(mg·L-1)382.1315.9298.6295.8237.5207.9160.9降解率Degrading rate/%23.636.840.340.852.558.467.8R403殘留量Residual content/(mg·L-1)287.6265.3190.7183.6179.3175.2170.8降解率Degrading rate/%28.133.752.354.155.256.257.3R401殘留量Residual content/(mg·L-1)267.4249.8208.3205.7203.6202.6201.9降解率Degrading rate/%33.237.647.948.649.149.449.5R402殘留量Residual content/(mg·L-1)281.9256.3219.5218.9217.3216.8215.6降解率Degrading rate/%29.535.945.145.345.745.846.1L403殘留量Residual content/(mg·L-1)297.2261.8235.1230.6228.3227.6227.3降解率Degrading rate/%25.734.641.242.442.943.143.2R503殘留量Residual content/(mg·L-1)388.7357.1303.8297.5294.1287.9286.7降解率Degrading rate/%22.328.639.240.541.242.442.7L302殘留量Residual content/(mg·L-1)268.1256.3253.9251.7250.1249.4248.7降解率Degrading rate/%10.614.715.416.116.616.917.1L203殘留量Residual content/(mg·L-1)186.2181.6179.5177.3176.5174.8173.4降解率Degrading rate/%6.99.210.311.411.812.613.3

表2L501對3種草莓根腐病病原菌的拮抗圈直徑

Table2Diameters of the inhibitory zones of strain L501 against three strawberry root rot

降解菌Degrading bacteria草莓根腐病病原菌Pathogenic fungi of strawberry root rot拮抗圈直徑Diameters of the inhibitory zones/mm透明度TransparencyL501L501L501F405 Fusarium solaniF403 Fusarium oxysporumF407 Fusarium culmorum15.014.511.0+++++++++

分子鑒定菌株L501的16S rDNA序列長度為1 456 bp，提交GenBank，獲得序列號為MG519283，用NCBI網(wǎng)站中BLAST程序進行L501的序列與其相似性極高的序列比較分析，與降解菌L501的16S rDNA序列同源性在99%以上的菌株均為Bacillussubtilis，初步將此菌株歸為芽孢桿菌屬，選GenBank中與L501菌株相似性較高的5個菌株構建系統(tǒng)進化樹，結果如圖3所示。綜上，依據(jù)16S rDNA序列相似性分析，結合菌株L501形態(tài)結構觀察，對照《常見細菌鑒定手冊》，鑒定菌株L501為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。

圖2 菌株L501顯微特征(1 000×)Fig.2 Morphological characters of the strain L501(1 000×)

3 結論與討論

研究表明，對草莓連作自毒作用的降解菌多為放線菌，如解靈軍等[12]報道的對羥基苯甲酸降解菌菌株B3512和毛寧等[13]報道的淡紫褐鏈霉菌、Streptomycessp.。研究顯示，降解菌制成的放線菌制劑能有效減輕草莓連作的自毒作用。孫敬祖等[14]研究表明，放線菌可以定殖在草莓根表，并在草莓連作障礙修復中起到防病促生作用。

圖3 菌株L501的16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the stain L501 based on 16S rDNA sequence

關于細菌對作物連作自毒作用的降解作用研究也有些報道。方艷芬等[15]研究表明，對苯甲酸的降解效果較好的細菌有假單胞菌、不動桿菌及產(chǎn)堿桿菌屬。而細菌作為草莓連作自毒作用的降解菌卻鮮見報道。何志剛等[16-17]通過研究表明，枯草芽孢桿菌作為花生和番茄自毒物質降解菌，對肉桂酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸和水楊酸都有較強的降解力，同時，它具有較強的拮抗能力，對根腐菌和Aspergillusflavus有拮抗作用，這是一種有潛力的生物防治菌。研究顯示，枯草芽孢桿菌是得到國內(nèi)外學者青睞的一種生防細菌，并已開發(fā)成相關生防試劑投放到市場[18]?？莶菅挎邨U菌作為生防菌能夠抑制草莓根腐病菌尖孢鐮刀菌和草莓枯萎病菌[19-20]。

本研究表明，篩選得到一菌株L501枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，而且其對草莓根系分泌物中的主要有害化感物質——苯甲酸有較強的降解作用，并能夠有效拮抗草莓根腐病菌。L501枯草芽孢桿菌系草莓根泌自毒物質苯甲酸的降解菌，具有成為草莓根腐病的生防菌潛力，可用于修復草莓重茬。本研究僅探索該菌株對苯甲酸的降解力，而其對混合酚酸類或其他自毒物質的降解能力以及在田間的實際修復效果，尚需進一步深入研究。