王希春，張婭菲，儲小燕，朱 雷，朱電鋒，馮士彬，李 玉，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱為嘔吐毒素，是一種主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的B型單端孢霉烯族毒素[1]，是世界上最常見的霉菌毒素之一。近年來，DON在糧食作物中污染的問題屢見不鮮，Wu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，中國不同省的飼料原料和全價飼料中的DON檢出率為93.9%。對2017年上半年全國飼料霉菌毒素檢測后發(fā)現(xiàn)，DON的檢出率為98.3%，平均含量為1 855.2 μg·kg-1，超過國家標準的最高限量標準[3]。動物采食DON污染的飼糧后，出現(xiàn)厭食、嘔吐、發(fā)熱、反應遲鈍等中毒癥狀，消化系統(tǒng)受到一定程度的損傷，并產(chǎn)生氧化應激[4]。在畜禽中，豬對DON的敏感性最強[5]。研究表明，高劑量DON可降低斷奶仔豬脾臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，并顯著提高丙二醛(MDA)的含量[6]。在DON與玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)的聯(lián)合作用下，可使仔豬血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量增加72.0%、32.6%和36.6%[7]。此外，DON還是蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑，其主要靶細胞為腸上皮細胞[8]，無論是低劑量還是高劑量的DON暴露均可導致不同程度的腸道損傷。目前，飼料中DON對仔豬抗氧化作用及機體生理生化、消化系統(tǒng)毒性的研究尚不完善。本試驗旨在通過對斷奶仔豬飼喂DON污染飼料，研究其對仔豬機體抗氧化指標、血清生化指標及腸道黏膜屏障的影響，為豐富和完善DON的毒性作用機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用 “杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，由安徽省青陽縣五星畜牧種豬場提供。

1.2 試劑和儀器

禾谷鐮刀菌由南京農(nóng)業(yè)大學中毒病實驗室惠贈；玉米購自合肥市農(nóng)貿(mào)市場；離心管、TIP頭，美國Axygen Biosciences公司；BSD-100振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；高效液相色譜儀，美國Waters公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；Multiskan Mk3型酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；TGL-18R臺式高速離心機，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；BS-220全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司；YD-1508R 輪轉(zhuǎn)式切片機，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；CX31光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；ELISA試劑盒，南京森貝迦生物技術(shù)有限公司。

1.3 DON飼糧的制備

將保存于4 ℃的禾谷鐮刀菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃復蘇培養(yǎng)，觀察禾谷鐮刀菌的生長情況。將復蘇好的禾谷鐮刀菌接種到察氏液體培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，120 r·min-125℃培養(yǎng)5～7 d。隨后將150 g干燥玉米裝入500 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)水分含量至45%，塞上軟膠塞，置于同一培養(yǎng)箱中，27 ℃培養(yǎng)20 d，取出錐形瓶，滅菌后烘干備用。將烘干的霉變玉米粉碎，使用液相色譜法，測定其中DON含量，然后與基礎(chǔ)飼糧(DON、ZEN含量分別為0.15、0.05 mg·kg-1)進行混合，分別制備含量為1 mg·kg-1與2 mg·kg-1的DON飼糧。

1.4 試驗動物分組與飼養(yǎng)管理

選取30頭21日齡斷奶仔豬(平均體質(zhì)量為6.87±0.41 kg)，隨機分為3欄，每欄10頭，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、低劑量DON飼糧(DON含量為1 mg·kg-1)、高劑量DON飼糧(DON含量為2 mg·kg-1)，試驗期為60 d。自由采食，自由飲水，每天觀察仔豬的采食和健康狀況，消毒免疫程序嚴格按照豬場管理方案進行。

1.5 檢測樣本的制備

1.5.1 血清的制備

在60 d時，對所有仔豬進行前腔靜脈采血，血液樣品靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min，制備血清，-20 ℃保存，用于測定相關(guān)血清指標。

1.5.2 小腸病理切片制作

試驗結(jié)束時，每組隨機選擇5頭仔豬放血致死，采集十二指腸、空腸中段、回腸中段各5 cm，置于10%甲醛溶液中固定。48～72 h 后取出固定的腸道樣本，進行石蠟包埋，切取5 μm切片并進行HE染色，封片后在光學顯微鏡下觀察。

1.6 檢測指標和方法

1.6.1 血清生化指標的測定

使用深圳邁瑞公司BS-220全自動生化分析儀進行血清生化指標測定。檢測指標包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、淀粉酶(α-AMY)、脂肪酶(LIP)、鈣(Ca)、磷(P)、肌酸激酶(CK)。所有指標的測定操作均按照說明書進行。

1.6.2 抗氧化性能指標的測定

分別用豬SOD、GSH-Px、CAT、NO、MDA ELISA試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 腸道通透性指標的測定

分別用豬DAO及D-乳酸(D-LA)ELISA檢測試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.4 小腸絨毛高度及隱窩深度的測量

小腸組織HE染色切片在40倍光學顯微鏡下觀察，分別選取10個典型視野(絨毛結(jié)構(gòu)完整、走向平直)，使用ISCapture V3.5數(shù)碼互動成像系統(tǒng)進行拍攝，在Image-Pro Plus 6.0軟件中測量各視野中絨毛高度及隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DON對斷奶仔豬抗氧化性能的影響

由表1可知，高劑量組血清中SOD、GSH-Px、CAT含量顯著低于對照組和低劑量組(P<0.05)；低劑量組顯著低于對照組(P<0.05)。高劑量組血清中NO含量較對照組顯著增加(P<0.05)。此外，高劑量組血清中MDA顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 DON對斷奶仔豬血清生化指標的影響

由表2可知，高劑量組血清中AST含量顯著低于對照組(P<0.05)，ALP含量顯著高于對照組(P<0.05)，γ-GGT顯著高于對照組與低劑量組(P<0.05)。高劑量組血清CREA顯著高于對照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)。高劑量組與低劑量組α-AMY含量顯著高于對照組(P<0.05)。高劑量組LIP顯著高于對照組(P<0.05)，CK顯著高于低劑量組與對照組(P<0.05)。

表1DON對斷奶仔豬抗氧化性能的影響

Table1Effect of DON on antioxidant capacity in weanling piglets

指標Indexes對照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group超氧化物歧化酶SOD/(ng·L-1)80.61±2.31 a70.79±3.30 b61.65±3.59 c谷胱甘肽-過氧化物酶GSH-Px/(ng·L-1)357.04±5.74 a340.86±5.59 b325.87±5.21 c過氧化氫酶CAT/(ng·L-1)28.89±1.45 a25.87±2.09 b19.43±1.26 c一氧化氮NO/(μmol·L-1)31.00±2.32 b31.24±1.07 ab34.13±4.90 a丙二醛MDA/(nmol·L-1)14.51±0.70 c17.56±1.33 b21.16±1.25 a

同行比較，無相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters wihin the same row indicated significant difference atP<0.05 . The same as follows.

2.3 DON對斷奶仔豬腸道通透性的影響

由表3可見：試驗開始時，各組間血清中DAO與D-LA含量無顯著差異。試驗結(jié)束后，血清中DAO、D-LA含量隨毒素劑量的增加而升高，各處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 DON對斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響

由表4可見：高劑量組十二指腸腸絨毛高度顯著高于對照組與低劑量組(P<0.05)，低劑量組腸絨毛則顯著低于其他組(P<0.05)?？漳c絨毛高度隨毒素劑量的增加而顯著降低(P<0.05)?；啬c對照組絨毛顯著高于毒素處理組(P<0.05)，且處理組腸絨毛隨毒素劑量的升高而降低，但不顯著。各腸段隱窩深度均無顯著變化。此外，絨毛高度與隱窩深度的比值所呈趨勢與絨毛高度相一致。

表2DON對斷奶仔豬血清生化指標的影響

Table2Effect of DON on serum biochemical indexes in weanling piglets

指標 Indexes對照組 Control group低劑量組 Low-dose group高劑量組 High-dose group谷丙轉(zhuǎn)氨酶 ALT/(U·L-1)51.73±6.0952.50±9.0558.95±3.46谷草轉(zhuǎn)氨酶 AST/(U·L-1)112.8±7.35 a91.80±2.83 ab77.05±8.70 b堿性磷酸酶 ALP/(U·L-1)282.73±11.72 b341.50±9.01 ab374.03±24.09 aγ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 γ-GGT/(U·L-1)95.27±3.84 b105.03±9.41 b151.10±30.18 a總蛋白 TP/(g·L-1)59.30±2.9956.20±4.3154.03±3.45白蛋白 ALB/(g·L-1)27.73±4.2824.30±3.9326.30±2.43球蛋白 GLB/(g·L-1)31.57±2.32 31.90±7.5427.73±2.87白蛋白/球蛋白 ALB/GLB0.90±0.170.80±0.260.93±0.12尿酸 UA/(μmol·L-1)12.30±2.4610.60±1.8710.13±2.76尿素 UREA/(mmol·L-1)4.54±0.634.11±0.365.05±0.88肌酐 CREA/(μmol·L-1)65.83±6.52 c 84.33±2.37 b96.23±7.06 a淀粉酶 α-AMY/(U·L-1)1 557.50±170.41 b2 586.35±172.75 a2 570.60±74.23 a脂肪酶 LIP/(U·L-1)4.63±0.25 b5.40±0.44 ab6.00±0.56 a鈣 Ca/(mmol·L-1)2.48±0.162.30±0.222.36±0.28磷 P/(mmol·L-1)3.91±0.083.79±0.444.22±0.59肌酸激酶CK/(U·L-1)962.45±26.38 b1 326.03±382.25 b2 196.03±248.32 a

表3DON對斷奶仔豬腸道通透性的影響

Table3Effect of DON on intestinal permeability in weanling piglets

指標Indexes試驗期experimental stage/d對照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group二胺氧化酶 DAO/(ng·L-1)028.23±3.1028.51±1.3428.61±1.386027.82±1.71 c31.71±3.88 b39.98±5.68 aD-乳酸 D-LA/(μg·L-1)064.21±5.74 70.18±12.6469.96±5.266062.41±14.11 c76.66±0.83 b 90.22±5.35 a

表4DON對斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響

Table4Effect of DON on small intestinal morphology in weanling piglets

指標Indexes腸段Intestinal segment對照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group絨毛高度十二指腸 Duodenum 605.07±178.21 b480.76±126.18 c750.92 ±190.28 aVillus height/μm空腸 Jejunum551.35±120.10 a470.27±127.51 b416.91±125.85 c回腸 Ileum475.76±130.55 a363.28±106.80 b345.39± 101.29 b隱窩深度十二指腸 Duodenum 1 007.74±218.271 020.87±178.101 034.83±182.02Crypt depth/μm空腸 Jejunum764.09±152.84781.50±135.83771.74±192.22回腸 Ileum673.56±121.44700.27±158.92674.56±150.95絨毛高度/隱窩深度十二指腸 Duodenum 0.60±0.13 b0.48±0.09 c0.70±0.16 aVillus height/Crypt depth空腸 Jejunum0.74±0.12 a0.67±0.15 b0.55±0.12 c回腸 Ileum0.70±0.17 a0.52±0.12 b0.50±0.13 b

由圖1可見：對照組的各腸段腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，杯狀細胞數(shù)量較多，未見明顯病理學變化；低劑量組十二指腸與空腸腸絨毛高度降低，杯狀細胞減少，其中十二指腸絨毛在高度降低的同時寬度增加；高劑量組十二指腸與空腸絨毛較其余兩組稀疏，且基本無杯狀細胞，十二指腸腺萎縮，空腸腸絨毛粘連、斷裂；在毒素處理的2組中，回腸除絨毛高度降低、絨毛稀疏外，其他形態(tài)變化并不明顯。

圖1 斷奶仔豬小腸組織病理切片(×40)Fig.1 Histopathological section of small intestinal tissues in weanling piglets (×40)

3 討論

玉米是畜禽飼料中的主要能量來源，DON是玉米最常見的霉菌污染物之一。由于飼料存放環(huán)境的溫度、濕度不易控制，使得DON污染問題越發(fā)嚴重。我國飼料衛(wèi)生標準GB 13078—2017中規(guī)定，豬配合飼料中DON最高限量為1 mg·kg-1，而歐盟關(guān)于仔豬飼料中DON的最高限量則更少，為0.9 mg·kg-1[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，豬在攝入含有0.6 mg·kg-1DON飼料后便可造成一定的器官損傷以及機體炎癥反應[10]。本試驗采用DON含量為1 mg·kg-1和2 mg·kg-1的飼糧進行試驗，以便為飼料的安全性應用提供參照。

動物出現(xiàn)氧化應激的特征為細胞內(nèi)出現(xiàn)大量活性氧，機體可通過一系列的酶促反應使得活性氧含量下降，動物機體內(nèi)的抗氧化劑包括ROS代謝酶，如SOD、GSH-Px以及CAT等[11]，此外還包括活性氮(RNS)，如NO等[12]，而MDA則是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，以上這些物質(zhì)在機體中的含量可以顯示動物所受氧化應激的程度。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，3 mg·kg-1DON可使斷奶仔豬血清中T-SOD、GSH-Px含量顯著降低。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，4 mg·kg-1DON可以顯著增加斷奶仔豬腎臟、回腸及空腸組織中的MDA含量，同時可以顯著降低血清中CAT的活性。本試驗中所得結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

血清生化指標是檢測動物機體是否處在正常內(nèi)環(huán)境之中的重要指標，一旦出現(xiàn)異常則提示相關(guān)臟器可能受到不同程度的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，高水平的γ-GGT及AST可以反映肝損傷或氧化應激[15]，ALP升高可以反映DON誘導的全身毒性所引起的肝臟代謝異常[11]。本試驗中，DON處理組血清中AST水平顯著下降，但γ-GGT與ALP含量顯著升高，這一結(jié)果與Wu等[2]、姬長云等[16]研究結(jié)果一致。α-AMY與LIP主要存在于胰腺、腸黏膜中，其中α-AMY是判定胰腺炎的重要指標之一[17]，LIP是檢測腸黏膜完整性的參數(shù)[18]。試驗中DON污染飼料飼喂仔豬后，仔豬血清中α-AMY、LIP含量均顯著上升，表明仔豬胰腺可能受損，同時腸黏膜屏障被破壞。此外，試驗中CREA升高說明腎臟可能受到一定程度的損傷。

腸道屏障對動物機體具有保護作用，DAO主要位于腸上皮細胞中，是一種高活性的細胞內(nèi)酶[19]。腸道黏膜受損，細胞內(nèi)的DAO可進入血液，最終使血液中DAO含量升高。此外，腸道屏障被破壞后，原本存在于腸腔內(nèi)的細菌代謝產(chǎn)物D-LA將進入血液，使血液中D-LA含量升高[20]。本試驗中，斷奶仔豬血清中DAO及D-LA含量隨飼料中毒素劑量的增加而升高，這也與Wu和Feng等[14，20]的研究結(jié)果一致，說明DON對腸道黏膜的通透性造成一定影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中含有12 μg·kg-1DON便可以使絨毛高度與隱窩深度之比降低[21]，而2～4 mg·kg-1或更高劑量的DON可使空腸杯狀細胞數(shù)量減少，空腸及回腸萎縮、腸絨毛變短[8，13，22]。本試驗中，飼料含1 mg·kg-1DON即導致仔豬小腸腸絨毛高度降低，尤其是十二指腸的絨毛在高度降低的同時寬度明顯增加，這可能是由于絨毛通過自身的收縮從而達到恢復自身屏障功能的目的[23]。高劑量組中，雖然十二指腸腸絨毛較其他2組顯著增高，但其絨毛密度明顯降低，同時上皮層中杯狀細胞數(shù)量明顯減少，且十二指腸腺萎縮，此外，空腸絨毛發(fā)生明顯粘連，表明2 mg·kg-1DON污染的飼糧可以對腸道造成更加嚴重的損傷。

綜上所述，本試驗中所使用的DON濃度可以導致斷奶仔豬機體氧化應激，引起部分血清生化指標異常，同時對小腸黏膜形態(tài)及腸道通透性也造成一定損傷。試驗中所使用的1 mg·kg-1DON為豬配合飼料國家限量標準，但足以使斷奶仔豬產(chǎn)生氧化應激并且使腸黏膜及其他臟器受到損傷，因此可推斷仔豬配合飼料中霉菌毒素DON的含量應低于1 mg·kg-1。