何云，汪有先，趙淑靜，包建強

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

鮟鱇魚（Lophius litulon），俗稱結(jié)巴魚、哈蟆魚、海 哈蟆、琵琶魚等，屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，于世界各大海洋均有分布，如大西洋、太平洋和印度洋。頭大、身小，體柔軟，無鱗，內(nèi)臟比重大，出肉率低，在加工過程中會產(chǎn)生60%以上[1]的下腳料，魚骨占了腳料的15%[2]。開展對鮟鱇魚骨的精深加工研究可以使鮟鱇魚骨資源得以合理開發(fā)利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟附加值。市面上的補鈣劑主要有三類，分別是有無機鈣、有機鈣和氨基酸鈣。但是無機鈣生物效價低、有機鈣溶解度大易溶失且價格高、氨基酸螯合鈣會產(chǎn)生顏色反應(yīng)并引發(fā)脂肪氧化[3]，且總體利用率不高，逐漸被第四代補鈣產(chǎn)品——膠原多肽螯合鈣[4]代替。膠原多肽螯合鈣作為新型的補鈣劑，可使鈣以離子形式與小肽結(jié)合，并借助小肽的轉(zhuǎn)運、吸收機制，以配合物的形式被小腸吸收，故而顯著促進鈣的利用率，且肽-Ca螯合物吸收速度快且可以減少很多生化過程，節(jié)約機體能量消耗[5]。多肽螯合鈣具有生物效價高、吸收快、營養(yǎng)高等優(yōu)點，具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖等活性，有很高的開發(fā)價值和應(yīng)用前景，日益成為國內(nèi)外研宄的熱點[6-7]。

本研究以鮟鱇魚骨為原料，經(jīng)鹽酸法提取魚骨中鈣源后，胃蛋白酶酶解獲得魚骨多肽，向其加入提取出的鈣源，制備膠原多肽螯合鈣。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳的螯合條件，并對其進行氨基酸分析，旨在為鈣補充劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚：舟山興業(yè)有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）：北京盈信陽光生物科技有限公司；牛血清、HCl、NaOH、無水乙醇、NaCl等：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

原子吸收分光光度計（TAS-990）、T6新世紀型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；L-8800型氨基酸分析儀：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；FOSS8400型全自動凱氏定氮儀：上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；Seven2Go型pH計、ME204型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；H1850R型高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱：上海鰲珍儀器制造有限公司；LFP-800T型多功能粉碎機：浙江省永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇魚骨膠原多肽酶解液的制備

新鮮冷凍的鮟鱇魚→預(yù)處理→提取鈣液→離心→酶解→離心→魚骨膠原多肽酶解液

魚骨膠原多肽酶解液的制備：取清洗干凈、脫脂、脫雜蛋白、經(jīng)80℃鼓風(fēng)干燥箱烘干9 h的魚骨，粉碎后過60目篩，用6.0%鹽酸浸泡、攪拌、脫鈣（60 min，40℃，料液比 1∶6（mg/m L），脫鈣率達到 31.21%，得鈣液）；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）酶解[料液比1 ∶15（mg/mL），溫度 40 ℃，時間 4 h，p H 1.0，加酶量6%（質(zhì)量分數(shù)）]，100℃滅酶 5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，70℃條件下活性炭吸附（添加量1%（質(zhì)量分數(shù)）），采用0.22 μm濾膜過濾（0.1 MPa，常溫），濃縮（45℃，0.1 MPa），制得鮟鱇魚骨膠原多肽酶解液。

1.3.2 鮟鱇魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝流程

魚骨膠原多肽酶解液→調(diào)節(jié)螯合條件（溫度、pH、質(zhì)量比、時間）→螯合→3倍無水乙醇沉淀螯合物→離心（8 000 r/min；10 min），收集沉淀→真空冷凍干燥（-108 ℃[16]，4.0 Pa，36 h～48 h）。

1.3.3 檢測方法

鈣含量的測定：火焰原子吸收光譜法（GB5009.92-2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》）。

計算公式如下：

1.3.4 螯合反應(yīng)單因素試驗

根據(jù)單一因素對膠原螯合鈣工藝參數(shù)的相關(guān)研究，在水系中合成膠原多肽螯合物時，影響合成反應(yīng)的主要因素有：質(zhì)量比、pH、螯合時間、螯合溫度等。因此，試驗以質(zhì)量比、pH、螯合時間、螯合溫度為考察因素。

1.3.4.1 最佳質(zhì)量比的確定

膠原多肽與鈣離子的結(jié)合有一定的配位比，設(shè)定pH 6.0、時間50 min、溫度50℃條件下，選擇酶解液中膠原多肽與鈣液的質(zhì)量比為 0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4∶1，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的質(zhì)量比。

1.3.4.2 最佳pH值的確定

設(shè)定質(zhì)量比為1∶1、時間50 min、溫度50℃，選擇pH 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的pH值。

1.3.4.3 最佳螯合時間的確定

設(shè)定質(zhì)量比為1∶1、pH 6.0、溫度50℃，選擇時間為 30、40、50、60、70 min，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的螯合時間。

1.3.4.4 最佳螯合溫度的確定

設(shè)定質(zhì)量比為 1 ∶1、pH 6.0、時間 50 min，選擇溫度為 30、40、50、60、70 ℃，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的螯合溫度。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以膠原多肽與鈣液質(zhì)量比、pH值、螯合時間、螯合溫度為影響因素，各選取3個水平，采用L9（34）試驗設(shè)計，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標，確定鮟鱇魚骨螯合鈣的最佳工藝條件。試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗設(shè)計表Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.6 螯合物中氨基酸組成成分分析

用氨基酸分析儀測定樣品氨基酸組成。取0.500 0 g的鮟鱇魚骨膠原多肽螯合鈣凍干粉樣品，加入10 mL，6 mol/L HCl，加入3～4滴苯酚，水解管放入冷凍劑中3 min～5 min，吹氮氣后封口，在110℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h，過濾，再溶解并定容至50 mL容量瓶。吸取1.0 mL作為測定氨基酸組成用的分析樣。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有指標均重復(fù)測定3次，采用Origin 8.0和Excel2003進行作圖，用SPASS 19.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原多肽與鈣液質(zhì)量比對螯合反應(yīng)的影響

膠原多肽與鈣液質(zhì)量比對螯合反應(yīng)的影響見圖1。

圖1 酶解液中膠原多肽與鈣液的質(zhì)量比對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.1 Effect of protein to calcium solution mass ratio on chelating rate and chelated calcium content

由圖1知，酶解液中膠原多肽與鈣液的質(zhì)量比對螯合率和螯合物中鈣含量影響顯著。配位體質(zhì)量過高，肽的利用率下降，配位體過低，螯合物不穩(wěn)定[8]。在質(zhì)量比為0.5∶1時，螯合物中鈣含量比較高，螯合率比較低，原因是很多鈣離子未參與螯合反應(yīng)。隨著質(zhì)量比的不斷增加，膠原蛋白結(jié)合位點的增多，螯合率不斷升高。當質(zhì)量比達到2∶1后，螯合率最高，說明配體質(zhì)量比的增大有利于螯合反應(yīng)的充分進行。當配體的質(zhì)量比大于2∶1后，鰲合率降低，說明有多余的膠原多肽未被螯合，造成膠原多肽浪費。劉永等[9]優(yōu)化羅非魚鱗膠原蛋白肽鈣螯合物的制備工藝時發(fā)現(xiàn)，螯合率隨肽與氯化鈣質(zhì)量比的增加而迅速增加，在3∶1時達到最高，繼續(xù)升高二者比例，螯合率降低。

2.2 螯合pH值對螯合反應(yīng)的影響

螯合pH值對螯合反應(yīng)的影響見圖2。

圖2 pH值對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.2 Effect of pH on chelating rate and chelated calcium content

由圖2可知，pH對于螯合率和螯合物中鈣含量影響顯著，酸性條件和堿性條件下螯合率和螯合物中鈣含量均相對較低。其原因是在低pH條件下，溶液中H＋大量存在時，H＋會與Ca2＋爭奪供電子基團，呈競爭關(guān)系，羧基配位能力較弱，不利于螯合物的形成[10]；而在高pH條件下，OH－與供電子基團爭奪鈣離子而形成氫氧化鈣沉淀[11]，經(jīng)無水乙醇洗后被除去。在弱酸、弱堿及中性條件下，配體受H＋和OH－影響較小，提供了充分的供電子基團，從而有利于鈣通過配位鍵形成螯合物[12]，與丁利君等[13]研究結(jié)果相似，在pH值影響下螯合率均呈現(xiàn)先增加后減小趨勢。

2.3 螯合溫度對螯合反應(yīng)的影響

螯合溫度對螯合反應(yīng)的影響見圖3。

由圖3可知，隨著溫度的升高，膠原多肽螯合率呈增大趨勢，40℃之后呈降低趨勢，螯合物中鈣含量先緩慢減少，40℃之后緩慢增加。夏光華等[14]研究發(fā)現(xiàn)螯合反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)，溫度過高不利于螯合反應(yīng)的進行，故而在溫度過高的情況下，螯合率呈下降趨勢。螯合物中鈣含量下降可能是因為溫度超過一定值，使膠原多肽螯合鈣發(fā)生部分分解，多肽螯合鈣是通過多肽的N-端氨基、C-端羧基、氨基酸側(cè)鏈以及肽鏈中的殘基和亞氨基與Ca2＋配位形成，此外，多肽對鈣還有吸附作用[15]，故而螯合物中鈣含量增加。

圖3 溫度對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.3 Effect of chelating temperature on chelating rate and chelated calcium content

2.4 螯合時間對螯合反應(yīng)的影響

螯合時間對螯合反應(yīng)的影響見圖4。

由圖4可知，螯合時間在30 min～50 min時，隨著時間的延長，螯合率和螯合物中鈣含量不斷升高，隨后螯合率和螯合物中鈣含量不斷下降，可能在開始階段，螯合時間短，反應(yīng)不徹底，游離鈣和配體充足；隨著螯合時間延長，已經(jīng)螯合的膠原多肽螯合鈣發(fā)生了解離，螯合率和螯合物中鈣含量不斷下降，可能由于羰基與氨基發(fā)生了羰氨反應(yīng)，減少了可以與鈣發(fā)生螯合的羰基和氨基的數(shù)量[16]，此結(jié)果與趙妍嫣等研究結(jié)果相符[17]。

圖4 螯合時間對螯合率速率的影響Fig.4 Effect of time on chelating rate and chelated calcium content

2.5 正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

單因素試驗最佳工藝參數(shù)：膠原多肽與鈣液質(zhì)量比 1 ∶1，2 ∶1，3 ∶1，pH 4～6，螯合時間 30 min～50 min，溫度30℃～50℃。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選定各因素較佳條件進行正交試驗，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2L9（34）正交試驗Table 2L9（34）orthogonal experiment analysis

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

以鰲合率為指標影響鮟鱇魚骨膠原多肽螯合反應(yīng)的主次順序為：pH（D）＞螯合溫度（C）＞螯合時間（B）＞質(zhì)量比（A），優(yōu)化工藝后最佳工藝組合為A2B3C1D3，即質(zhì)量比2∶1，螯合時間50 min，螯合溫度30℃，pH 6，其主體間效應(yīng)的檢驗顯示A、B、C、D間差異性顯著。以螯合物中鈣含量為指標影響鮟鱇魚骨膠原多肽螯合反應(yīng)的主次順序為：pH（D）＞質(zhì)量比（A）＞螯合時間（B）＞螯合溫度（C），優(yōu)化工藝后最佳工藝組合為A1B3C2D3，即提質(zhì)量比 1∶1，螯合時間 50 min，螯合溫度40℃，pH 6，其主體間效應(yīng)的檢驗顯示 A、B、C、D 間差異性顯著。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 Experiment results of verification

通過調(diào)整試驗方案，在A2B3C1D3條件下，鰲合率為98%，螯合物中鈣含量為21.29%，在A1B3C2D3條件下進行試驗，鰲合率為97.17%，螯合物中鈣含量為20.98%。由試驗結(jié)果知，A2B3C1D3條件下鰲合率最大為98%，且螯合物中鈣含量最高為21.29%，故其最優(yōu)工藝組合為：A2B3C1D3即膠原多肽與鈣液質(zhì)量比2∶1，螯合時間50 min，螯合溫度30℃，pH 6。此結(jié)果略高于楊燊[18]、陸劍鋒[19]、黃薇等[20]分別對南海低值魚蛋白、斑點叉尾鮰魚骨膠原多肽、鱈魚皮復(fù)合肽與鈣的螯合率，且螯合物中的鈣含量高于彭巧云等[21]的研究結(jié)果。產(chǎn)生這種差異的原因，可能是由于原料種類、膠原多肽的氨基酸組分、膠原多肽分子質(zhì)量等不同，導(dǎo)致最佳螯合條件不同，使其螯合率及螯合物中鈣含量高低不同。

2.6 膠原多肽螯合鈣的氨基酸組成分析

在優(yōu)化條件下制備的膠原多肽螯合鈣經(jīng)酸解后，進行氨基酸組成成分分析，測定結(jié)果如表5所示。

表5 螯合鈣中氨基酸組分Table 5 Amino acid composition of calcium-chelating collagen polypeptide

螯合鈣中的未檢測到色氨酸，酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸含量較少，谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸含量較多其中脯氨酸與羥脯氨酸含量約占總氨基酸含量的17.37%，符合膠原多肽的氨基酸組成[22]。

3 結(jié)論與討論

本試驗首次選用鮟鱇魚骨制備膠原多肽，并與鈣進行螯合，得到既能夠補充人體膠原多肽，又能補充人體鈣的膠原多肽螯合鈣。通過單因素和四因素三水平正交優(yōu)化試驗，得到膠原多肽液和鈣離子的最佳螯合條件為：溫度30℃、pH6、時間50 min，膠原多肽與鈣的配比為2∶1，此條件下的鈣螯合率為98%，螯合物中鈣含量為21.29%。

對螯合物進行氨基酸分析，具有典型的膠原多肽氨基酸組成特征。紅外光譜分析表明膠原多肽的氨基和羧基都與鈣發(fā)生了配位、離子結(jié)合，膠原多肽與鈣進行了成功的螯合。電鏡掃描分析表明部分鈣離子吸附在膠原多肽上，說明膠原多肽與鈣離子也有一定的吸附作用。

膠原多肽螯合鈣是由魚骨膠原多肽與鈣離子螯合而成，在螯合過程中膠原多肽除了與鈣離子發(fā)生螯合作用外，同時還存在其他一些羰氨反應(yīng)等，若發(fā)生羰氨會減少與鈣離子螯合的膠原多肽基團。膠原多肽螯合鈣的功能性、毒性、溶解性、穩(wěn)定性和不同分子質(zhì)量的吸收性，可能因不同膠原多肽分子量不同而不同，以及膠原多肽螯合該的氨基酸組成序列，均可作為下一步研究的重點。