張立攀，周莉，關炳峰，王法云，劉紅偉，高火亮，賈艷，羅蓓蓓，李鵬沖

（河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，河南鄭州450000）

我國柿和柿子葉資源非常豐富，柿的種類超過40種，種植地域廣泛，在東部、南部山區(qū)，華北、東北平原和西北高原地區(qū)均有分布[1-3]?，F(xiàn)代社會對柿子的產品開發(fā)水平較高，包括各種即食、保健、發(fā)酵食品和美容及清潔產品，但是對柿子葉的產品開發(fā)較少。近來研究發(fā)現(xiàn)，柿子葉中復雜的化學成分中，某些成分對人體健康有很大益處，可用于咳喘、肺氣脹的治療以及其他臨床疾病[4-10]的治療。這些有益成分包括黃酮、酚類有機酸[11-14]、維生素類與微量元素等營養(yǎng)成分[15-17]。其中，黃酮是最重要的組分且含量較高。柿子葉資源豐富、來源廣泛，而作為柿子葉中有益成分重要的組成，黃酮類化合物具有很多對健康有益的生理作用[18-19]，因此柿子葉總黃酮的研究及其相關的深加工產品開發(fā)，是對現(xiàn)有資源的深入開發(fā)和利用，具有良好的前景。

從各種植物中提取總黃酮的方法，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，總的來說包括這幾種：常溫、低溫、高溫和高壓提取法[20-23]。這些方法普遍存在一些弊端，如能耗高，工藝操作復雜，得率較低，設備要求高等。近年來，隨著超聲波技術的發(fā)展，開始有學者將超聲波技術應用到提取植物中總黃酮類化合物中[24-32]。在提取植物有效成分時使用超聲波技術有幾大優(yōu)勢：一是提取得率明顯升高；二是提取速度快；三是可以做到對有效成分的無損提取[33]。應用超聲波技術研究提取柿子葉中總黃酮，確定總黃酮的得率為考量的指標，分別進行單因素和正交試驗，得到高效的柿子葉黃酮類物質的提取工藝，為柿子葉的深度開發(fā)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿子葉：河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司林地；蘆丁（液相濃度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（C2H5OH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、九水合硝酸鋁（Al（NO3）3·9H2O）、苛性鈉（NaOH）均為分析純。

UV-8000ST雙光束紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-2000A快速旋轉蒸發(fā)儀：上?？粕齼x器有限公司；KQ-700DE型超聲波發(fā)生器：上海昆山儀器有限公司；QJ-08B粉碎機：上海兆申科技有限公司；DHG-9052A型臺式電熱干燥箱：上海捷呈實驗儀器有限公司；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多國際貿易有限公司；分樣篩：上虞市五四儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 柿子葉預處理

柿子葉經(jīng)自然風干后，在電熱干燥烘箱烘焙至干，其烘制程序設定溫度為50℃，時間為6 h；用粉碎機將烘干的樣品磨碎，然后過60目分樣篩并收集。

1.2.2 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取工藝

試驗對象為預處理后的柿子葉粉。稱取設定質量的柿子葉粉，加入到設定濃度和體積的溶劑中；然后，按照設定的超聲浸提時間、超聲浸提溫度和超聲浸提次數(shù)進行提取。提取物經(jīng)過濾，少量溶劑潤洗濾渣；所有濾液旋干，殘留物用60%乙醇（體積比）溶解，并定容至100 mL容量瓶中，為樣品待測儲備液。

1.2.3 柿子葉總黃酮含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

根據(jù)方法[24]測定蘆丁的標準曲線為：y=9.173 2x-0.006 1，R2=0.999 7。標準曲線見圖1。

1.2.3.2 總黃酮含量的測定

為提高試驗的精密性，統(tǒng)一設定預處理柿子葉粉的稱取重量為2.00 g，樣品待測儲備液的移取量為4.00 mL，定容至50 mL，按照方法[24]中的操作步驟進行測定。公式如下：

得率/%=（測定液中總黃酮的質量/柿子葉粉樣品的質量）×25×100

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

計算不同試驗組提取液的柿子葉提取物總黃酮含量。

1.3 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取單因素試驗

1.3.1 溶劑中乙醇濃度的影響

取超聲浸提溫度50℃，并保持恒溫狀態(tài)，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提時間取15 min，溶劑中乙醇濃度分別取 0、30%、50%、60%、70%、80%、95%，進行提取試驗。研究不同溶劑中乙醇濃度與提取物得率的相互變化關系與趨勢。

1.3.2 超聲浸提溫度的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，超聲浸提時間取15 min，料液比取 1 ∶20（g/mL），超聲浸提溫度分別取30、40、50、60、70 ℃，進行提取試驗。研究不同超聲浸提溫度與提取物得率的相互變化關系與趨勢。

1.3.3 超聲浸提時間的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時間分別取10、25、40、55、70、85 min，進行提取試驗。研究不同超聲浸提時間與對提取物得率的相互變化關系與趨勢。

1.3.4 料液比

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，超聲浸提時間取40 min，超聲浸提溫度取60℃，料液比分別取1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），進行提取試驗。研究不同料液比與提取物得率的相互變化關系與趨勢。

1.3.5 超聲浸提次數(shù)的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，料液比取1∶25（g/mL），超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時間取40 min，超聲浸提次數(shù)分別取1、2、3、4分別進行試驗。研究不同超聲浸提次數(shù)與提取物得率的相互變化關系與趨勢。

1.4 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取的正交試驗

通過對單因素試驗結果的分析，得知超聲浸提次數(shù)對提取物得率的影響較小。故選擇影響因素較大的溶劑中乙醇濃度、超聲浸提溫度、超聲浸提時間和料液比進行正交試驗。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溶劑中乙醇濃度的影響

溶劑中乙醇濃度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系見圖2。

圖2 溶劑中乙醇濃度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves

由圖2可知：在設定的溶劑中乙醇濃度范圍內，當溶劑中乙醇濃度低于60%時，隨著溶劑中乙醇濃度的增加，得率先升高，在達到60%時開始下降。這可能因為大于此濃度時，柿子葉中某些脂溶性物質溶出增加，對得率造成影響[34]。故選取溶劑中乙醇濃度為55%～65%。

2.1.2 超聲浸提溫度的影響

超聲浸提溫度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系見圖3。

圖3 超聲浸提溫度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

由圖3可知，在設定的超聲浸提溫度范圍內，得率以60℃為分界點表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。這是由于溫度繼續(xù)升高時，可溶性蛋白質溶出變性，溶液黏度增大，影響細胞的破裂，抑制了黃酮類物質的溶出，降低了得率[34]。故選擇超聲浸提溫度58℃～62℃。

2.1.3 超聲浸提時間的影響

超聲浸提時間與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系見圖4。

圖4 超聲浸提時間與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids frompersimmon leaves

由圖4可知，按照設定的超聲浸提時間范圍，提取物得率迅速升高，在達到40 min以后出現(xiàn)輕微下降。這可能是在超聲波作用下，目的物的溶出在較短的時間內就達到平衡了，而后隨著時間的增加，溶劑有逸失造成的[35]。故選擇超聲浸提時間40 min～55 min。

2.1.4 料液比的影響

料液比與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系見圖5。

圖5 料液比與柿子葉總黃酮提取得率的變化關系Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavones from persimmon leaves

由圖5可知，在設定的料液比范圍內，得率隨著溶劑量的增加而逐漸增大，在料液比1∶25（g/mL）時，再增加溶劑，得率反而趨于穩(wěn)定。增加溶劑，使得黃酮類化合物分子傳質到溶液中的總量在增多，在料液比達到1∶25（g/mL）以后黃酮類的浸出趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加溶劑量只會增加雜質的浸出。故選擇料液比為1 ∶22（g/mL）～1 ∶27（g/mL）。

2.1.5 超聲浸提次數(shù)的影響

超聲浸提次數(shù)與柿子葉總黃酮得率的變化關系見圖6。

圖6 超聲浸提次數(shù)與柿子葉總黃酮得率的變化關系Fig.6 Effect of extraction times on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

根據(jù)圖6可得到結論：在超聲浸提次數(shù)2次時，得率迅速達到最大值并保持基本恒定，且提取次數(shù)取1和2時，得率相差較小。這說明超聲波輔助提取的效率的確是較高的，同時一定程度上也說明超聲提取次數(shù)對得率的影響因素相對較小。故選擇提取次數(shù)為2次。

2.2 柿子葉總黃酮提取的正交試驗

據(jù)因素水平表，并按照試驗中提取物的操作步驟進行正交試驗分析結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test method

續(xù)表3 方差分析Continue table 3 Variance analysis of orthogonal test method

根據(jù)表2、表3的結果，可以判斷出：對柿子葉中提取物總黃酮得率影響，在各個因素條件中，溶劑中乙醇濃度具有較大顯著性；各因素條件的影響大小依次為：溶劑中乙醇濃度＞料液比＞超聲浸提溫度＞超聲浸提時間。說明溶劑中乙醇濃度在超聲輔助提取柿子葉總黃酮的過程中起著首要作用。正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件組合為A2B2C2D3，即溶劑中乙醇濃度取60%，超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時間取50 min，料液比取1∶27（g/mL）；為驗證正交設計試驗的結果，在此最優(yōu)條件下，5次平行驗證試驗提取物總黃酮的得率平均值達到4.82%。

3 結論

首先設計單因素試驗，研究了各個因素條件與提取物總黃酮得率的相互變化關系或趨勢；并在此基礎上，通過正交設計優(yōu)化試驗得到最優(yōu)工藝。結果表明提取物總黃酮得率的影響因素的主次順序為：溶劑中乙醇濃度＞料液比＞超聲浸提溫度＞超聲浸提時間；最優(yōu)工藝條件為：超聲浸提次數(shù)2次、超聲浸提時間50 min、超聲浸提溫度60℃、溶劑中的乙醇濃度60%、料液比1∶27（g/mL）；在此最優(yōu)組合條件下，測定提取物的得率為4.82%。