劉冀婕，黃玲艷，曾照準(zhǔn)，孫霽寒，王虹懿，彭景

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

桂花（Osmanthus fragrans Lour．）又名木樨、金栗、九里香，為木犀科屬植物，是我國(guó)十大傳統(tǒng)花卉之一。桂花不僅是著名的觀賞及芳香植物，也是重要是食用及藥用植物。目前關(guān)于桂花的研究多集中于芳香物質(zhì)、提取工藝以及體外抗氧化活性。已有研究發(fā)現(xiàn)[1]，桂花中蘊(yùn)藏著豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和黃酮類化合物。楊秀蓮等研究證實(shí)不同品種桂花間的營(yíng)養(yǎng)成分差別很大[2]，國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道桂花的各種化合物的提取工藝以及抗氧化活性，主要集中在黃酮類、多酚和多糖[3-5]，現(xiàn)已普遍認(rèn)為桂花具有降血糖、清除自由基、抗氧化、抗炎等作用。由此可推斷桂花可能有延長(zhǎng)壽命、抗衰老的作用。

衰老是人類生活的一個(gè)自然生理過(guò)程，受復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制，其特點(diǎn)是細(xì)胞和組織功能逐漸衰退。關(guān)于衰老的機(jī)理，以Harman[6]提出的自由基學(xué)說(shuō)最具有代表性。機(jī)體會(huì)通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基通過(guò)多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA），可引起細(xì)胞代謝及功能障礙，加速機(jī)體衰老。但機(jī)體存在直接清除自由基，抑制自由基的生成或是激活機(jī)體抗氧化體系的自由基清除劑，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（catalase，CAT）等酶類清除劑。

果蠅生命周期短，成本低，且具有與人類十分相似的衰老基因[7]，因此常被作為研究延緩衰老和抗氧化的生物模型。本文以雄性O(shè)regon K野生型紅眼黑腹果蠅為生物模型，研究桂花提取物的抗氧化作用及其對(duì)果蠅壽命的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用桂花提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑、設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Oregon K野生型紅眼黑腹果蠅：溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

桂花提取物：參照李姝[8]的方法，略有改動(dòng)，金桂花采摘陰干后置于烘干箱中，50℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩。取金桂花粉末200 g，按料液比1∶8（g/mL）加入80%乙醇，浸泡14 h后在50℃水浴條件下回流浸提3 h，濾渣重復(fù)提取3次，合并萃取液，萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃，-0.1 MPa減壓濃縮，0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，得浸膏即桂花醇提物，桂花醇提物的成分主要為多酚類化合物、黃酮和多糖。補(bǔ)充無(wú)水乙醇使桂花醇提物總質(zhì)量為100 g，則該1 g桂花提取物相當(dāng)于2 g金桂花的有效成分，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

無(wú)水乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；乙醚：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)羥基苯甲酸乙酯、瓊脂粉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米粉：市售；酵母粉：安琪酵母股份有限公司；總蛋白（total protein，TP）試劑盒、過(guò)氧化氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒：南京建成生物工程有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

BS22九陽(yáng)料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；BS224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VPH11-5T超純水儀：四川優(yōu)普超純科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HSX-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SX-500快速自動(dòng)高壓滅菌器：上海珂淮儀器有限公司；Allegra X-22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Benckman Coulter公司；Vortex-Genie2旋渦混勻器：美國(guó)Scientific Industries公司；Spectrumlab755s可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：參照王彥平等[9]的配方，蒸餾水750 mL、酵母 10 g、葡萄糖 72 g、玉米粉 72 g、瓊脂 6 g、75%乙醇水溶液40 mL（含1%對(duì)羥基苯甲酸乙酯）；分別用蒸餾水溶解玉米粉、葡萄糖、瓊脂粉、酵母粉，葡萄糖和瓊脂粉溶解后加熱至沸騰，加入已溶的玉米糊和乙醇水溶液，不斷攪拌至黏稠，沸騰后暫停加熱，加入溶解的酵母粉，攬拌均勻，冷卻前用注射器將其分裝到培養(yǎng)管，每管大約2 mL。

試驗(yàn)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加2.5、5、10、15 mg/mL桂花提取物，配制成不同濃度的試驗(yàn)培養(yǎng)基。

1.2.2 果蠅的生存實(shí)驗(yàn)

收集2 d齡雄性果蠅成蟲1 000只，隨機(jī)分為對(duì)照組、桂花提取物劑量組（2.5、5、10、15 mg/mL）共 5組，每組5管，每管40只，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)[溫度（25±0.5）℃，濕度（60±5）%]，每 4天更換一次培養(yǎng)基并記錄果蠅的死亡數(shù)量至全部死亡。計(jì)算平均壽命、最高壽命[10]和延壽率[11]，延壽率/%=（處理組平均壽命-對(duì)照組平均壽命）/對(duì)照組平均壽命×100，并繪制生存曲線。

1.2.3 桂花提取物對(duì)應(yīng)激條件下果蠅壽命的影響

1.2.3.1 急性氧化損傷實(shí)驗(yàn)

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[9]的方法。養(yǎng)至第25天后，饑餓2 h，用CO2麻醉后導(dǎo)入無(wú)培養(yǎng)基的干凈試管中，將沾有含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液的濾紙條放入試管，每4小時(shí)記錄果蠅死亡數(shù)目，直至全部死亡，并繪制生存曲線。

1.2.3.2 SDS急性損傷實(shí)驗(yàn)

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[12]。養(yǎng)至第25天后，饑餓2h，均給予6%葡萄糖溶液（含6mg/mL SDS），每4小時(shí)記錄死亡數(shù)至全部死亡，繪制生存曲線。

1.2.3.3 果蠅的熱應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[13]。第25天齡時(shí)放入（35±1）℃培養(yǎng)箱，每4小時(shí)記錄其死亡數(shù)至全部死亡，繪制生存曲線。

1.2.4 果蠅體內(nèi)氧化指標(biāo)的測(cè)定

收集2 000只2 d齡雄性果蠅成蟲，隨機(jī)分為對(duì)照組、桂花提取物劑量組（2.5、5、10、15 mg/mL）共 5 組，每組10管，每管40只，培養(yǎng)方法同生存實(shí)驗(yàn)。在第25天和第45天時(shí)，將果蠅饑餓處理2 h，每組用CO2麻醉5管，稱重。按照果蠅體重1∶49（mg/mL）的比例加入生理鹽水，冰浴勻漿，2 500 r/min，4℃離心15 min，吸取上清，取上清液按試劑盒說(shuō)明測(cè)定果蠅體內(nèi)血清總蛋白含量（mg/mL）、總超氧化物歧化酶、Cu，Zn-SOD活性（U/mL）、CAT活性（U/mL）和MDA含量（nmol/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花提取物對(duì)果蠅壽命的影響

桂花提取物對(duì)果蠅壽命的影響見表1，果蠅生存曲線見圖1。

表1 桂花提取物對(duì)果蠅壽命的影響Table 1 Effect of Osmanthus extract on drosophila melanogaster lifespan

圖1 果蠅生存曲線Fig.1 Drosophila melanogaster survival curve

由表1可知，與對(duì)照組相比，桂花提取物劑量組果蠅的平均壽命和最高壽命均有所增長(zhǎng)，延壽率分別為3.28%、3.43%、13.58%、20.83%，其中 10、15 mg/mL劑量組平均壽命的差異極其顯著（P＜0.01），5 mg/mL劑量組最高壽命有顯著差異（P＜0.05），10、15 mg/mL劑量組最高壽命的差異極顯著（P＜0.01）。

由圖1可看出，36天齡后，各組存活率明顯下降，但各劑量組存活率均高于對(duì)照組。另外，與對(duì)照組相比，隨著桂花提取物劑量的增加，果蠅生存曲線逐漸發(fā)生右移。

2.2 桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)TP含量的影響

桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)血清總蛋白含量的影響見表2。

由表2可知，空白對(duì)照組在45 d齡時(shí)的體內(nèi)TP含量低于25 d齡的果蠅體內(nèi)TP含量，而各劑量組果蠅體內(nèi)TP含量均高于25 d齡的果蠅。在25 d齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，各劑量組雄性果蠅體內(nèi)TP含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在45 d齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，劑量組均能提高果蠅體內(nèi)TP含量，15 mg/mL劑量組能顯著提高果蠅體內(nèi) TP 含量（P＜0.05），但 2.5、5、10 mg/mL劑量組TP含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)血清總蛋白含量的影響Table 2 Effect of Osmanthus extract on TP content in drosophila melanogaster

2.3 桂花提取物對(duì)果蠅SOD活性的影響

桂花提取物對(duì)果蠅超氧化物歧化酶活性的影響見表3。

表3 桂花提取物對(duì)果蠅超氧化物歧化酶活性的影響Table 3 Effect of Osmanthus extract on SOD activity in drosophila melanogaster

由表3可知，對(duì)照組和劑量組果蠅在45 d齡時(shí)體內(nèi)T-SOD活性均比25 d齡時(shí)高。與對(duì)照組相比，25 d齡時(shí)，劑量組均能提高果蠅體內(nèi)T-SOD活性，其中2.5 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)T-SOD活性明顯提高，差異顯著（P＜0.05），5、10、15 mg/mL 劑量組果蠅 T-SOD顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。45 d齡時(shí)，與對(duì)照組相比，各劑量組果蠅體內(nèi)T-SOD活性均顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

由表3可知，空白對(duì)照組和2.5 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的Cu，Zn-SOD活性在45 d齡時(shí)較25 d齡略有下降。5、10、15 mg/mL劑量組的果蠅在45 d齡的Cu，Zn-SOD活性較25 d齡均略有提高。與對(duì)照組相比，25 d齡時(shí)，劑量組均能提高果蠅體內(nèi)T-SOD活性，其中5、10、15 mg/mL劑量組果蠅Cu，Zn-SOD顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。45 d齡時(shí)，與對(duì)照組相比，各劑量組果蠅體內(nèi)Cu，Zn-SOD活性均有所提高，其中5、10、15 mg/mL 劑量組果蠅 Cu，Zn-SOD 顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.4 桂花提取物對(duì)果蠅CAT活性的影響

桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)CAT活性的影響見表4。

表4 桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性的影響Table 4 Effect of Osmanthus extract on CAT activity in drosophila melanogaster

由表4可知，空白對(duì)照組果蠅體內(nèi)的CAT活性在45 d齡時(shí)較25 d齡略有下降，而各劑量組果蠅體內(nèi)CAT活性在45d齡時(shí)較25d齡均有所提高。與對(duì)照組相比，在25 d齡時(shí)，2.5 mg/mL和5 mg/mL劑量組果蠅的CAT 活性略有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；10 mg/mL和15 mg/mL劑量組果蠅的CAT活性明顯提高（P＜0.05）；在45 d齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，各劑量組果蠅的CAT活性極顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.5 桂花提取物對(duì)果蠅MDA含量的影響

桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)MDA含量的影響見表5。

表5 桂花提取物對(duì)果蠅體內(nèi)丙二醛含量的影響Table 5 Effect of Osmanthus extract on MDA content in drosophila melanogaster

由表5可知，空白對(duì)照組和各劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量在45 d齡時(shí)較25 d齡均略有提高。其中，在25 d齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，2.5 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量略有下降，但差異不顯著（P＞0.05）；5 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），10 mg/mL和15 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量顯著下降，差異極其顯著（P＜0.01）；在45 d齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，2.5、5 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量略有下降，但差異不顯著（P＞0.05），10 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），15 mg/mL劑量組果蠅體內(nèi)的MDA含量顯著下降，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.6 桂花提取物對(duì)急性氧化損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對(duì)急性氧化損傷果蠅壽命的影響見表6。

由表6可知，與對(duì)照組相比，各劑量組均能延長(zhǎng)急性氧化損傷果蠅的平均壽命和最高壽命。其中，除2.5 mg/mL劑量組外，各劑量組均極其顯著提高了平均壽命（P＜0.01）。5 mg/mL劑量組明顯提高了最高壽命（P＜0.05），其余劑量組極其顯著（P＜0.01）。

表6 桂花提取物對(duì)急性氧化損傷果蠅壽命的影響Table 6 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in·OH acute experiment

2.7 桂花提取物對(duì)SDS急性損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對(duì)SDS急性損傷果蠅壽命的影響見表7。

表7 桂花提取物對(duì)SDS急性損傷果蠅壽命的影響Table 7 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in SDS acute experiment

由表7可知，與對(duì)照組相比，各劑量組均能延長(zhǎng)SDS急性損傷果蠅的平均壽命，但除15 mg/mL劑量組能極顯著提高果蠅平均壽命外（P＜0.01），其余劑量組差異均不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，各劑量組均能延長(zhǎng)SDS急性損傷果蠅的最高壽命，其中10、15 mg/mL劑量組能極顯著提高果蠅最高壽命（P＜0.01），5 mg/mL 劑量組能明顯提高（P＜0.05），2.5 mg/mL差異不顯著（P＞0.05）。

2.8 桂花提取物對(duì)熱應(yīng)激損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對(duì)熱應(yīng)激損傷果蠅壽命的影響見表8。

表8 桂花提取物對(duì)熱應(yīng)激損傷果蠅壽命的影響Table 8 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in acute experiment of heat temperature

由表8可知，桂花提取物各劑量組均能延長(zhǎng)熱應(yīng)激損傷果蠅的平均壽命和最高壽命。其中，與對(duì)照組相比，10、15 mg/mL劑量組極其顯著地延長(zhǎng)了平均壽命的（P＜0.01），2.5 mg/mL劑量組延長(zhǎng)了平均壽命，差異具有顯著性（P＜0.05），2.5、5 mg/mL 和 15 mg/mL 劑量組能顯著延長(zhǎng)最高壽命（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

正常情況下，機(jī)體通過(guò)產(chǎn)生和清除自由基維持機(jī)體的正常生理功能，使生物體保持平衡。但是機(jī)體隨著年齡的增長(zhǎng)，新陳代謝異常，出現(xiàn)各種代謝綜合征[14]，使自由基大量產(chǎn)生，氧化和抗氧化平衡狀態(tài)受到破壞，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，因此本研究不僅設(shè)計(jì)了壽命試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定了果蠅體內(nèi)SOD、CAT的活性以及MDA的含量。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，桂花提取物不同劑量組均能不同程度延長(zhǎng)果蠅的平均壽命和最高壽命，尤其是10、15 mg/mL劑量組效果最為顯著（P＜0.01）。桂花提取物10、15 mg/mL劑量組能顯著增加25 d齡果蠅體內(nèi)CAT活性（P＜0.05），所有劑量組能極顯著增加45 d 齡果蠅體內(nèi) CAT 活性（P＜0.01），5、10、15 mg/mL劑量組能極顯著增加25 d齡和45 d齡果蠅體內(nèi)SOD活性（P＜0.01），桂花提取物通過(guò)增加SOD、CAT活性從而提升果蠅自身的抗氧化能力。另外，由實(shí)驗(yàn)可知，10、15 mg/mL劑量組能極顯著降低25 d齡果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.01），15 mg/mL劑量組能極顯著降低45 d齡果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.01），說(shuō)明桂花提取物能在不同程度上降低果蠅體內(nèi)MDA的含量，具有抑制MDA對(duì)機(jī)體組織造成損傷的作用，可以減輕機(jī)體氧化應(yīng)激的水平，延緩衰老。

除了新陳代謝異常外，機(jī)體在一些應(yīng)激狀態(tài)下也會(huì)導(dǎo)致自由基異常增多，從而加速機(jī)體的衰老與死亡。本研究設(shè)計(jì)了急性氧化損傷模型、SDS損傷模型、熱應(yīng)激損傷模型3個(gè)應(yīng)激損傷模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桂花提取物也能延緩應(yīng)激狀態(tài)下果蠅的壽命，而10、15 mg/mL劑量組與對(duì)照組的差異極為顯著（P＜0.01）。

中醫(yī)理論中提倡“藥食同源”，使功效與安全性兼得，是開發(fā)抗衰老保健食品的良好來(lái)源[15]。本研究結(jié)果表明桂花具有極顯著的抗氧化、延緩衰老的作用，是繼人參、枸杞等目前研究較多的可食性中藥后又一可開發(fā)的抗衰老產(chǎn)品。為之后研究桂花對(duì)免疫功能的影響，明確其抗衰老活性機(jī)制，進(jìn)一步開發(fā)利用桂花提供參考。